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关于特定种类的微生物，客户可告知物种信息及引物信息，微基生物针对目标微生物进行qPCR定量分析；也可告知感兴趣的物种名称，微基生物来查询相关引物信息；如老师感兴趣的物种信息尚未见文献报道，微基生物可以开发程序，自行研发寻找目标菌株的特异基因并设计目标菌株的特异引物，验证引物的特异性，进行后继实验。
微基生物已检测过的物种信息，见表格（仅列出了常见的部分微生物种类），其他的微生物也可以检测。
| 级别 | 中文名称 | 英文名称 | | 界 | 细菌 | Bacteria | | 界 | 真菌 | Fungi | | 界 | 古菌 | Archaea | | 门 | 放线菌门 | Actinobacteria | | 门 | 拟杆菌门 | Bacteroidetes | | 门 | 厚壁菌门 | Firmicutes | | 纲 | alpha变形菌纲 | Alpha-proteobacteria | | 纲 | gamma变形菌纲 | Gamma-proteobacteria | | 科 | 肠杆菌科 | Enterobacteriaceae | | 科 | 瘤胃球菌科 | Ruminococcaceae | | 属 | 双歧杆菌属 | Bifidobacterium | | 属 | 大肠杆菌属 | Escherichia | | 属 | 乳酸杆菌属 | Lactobacillus | | 属 | 梭菌属 | Clostridium | | 属 | 肠球菌属 | Enterococcus | | 属 | 拟杆菌属 | Bacteroides | | 属 | 奇异菌属 | Atopobium cluster | | 属 | 链球菌属 | Streptococcus | | 属 | 瘤胃球菌属 | Ruminococcus | | 属 | 粪杆菌属 | Faecalibacterium | | 属 | 布劳特菌属 | Blautia | | 属 | 艰难梭菌属 | Clostridium difficile | | 属 | 脱硫弧菌属 | Desulfovibrio | | 属 | 另支菌属 | Alistipes | | 属 | 链球菌属 | Streptococcus | | 属 | 萨特氏菌属 | Sutterella | | 属 | 丙酸杆菌属 | Propionibacterium | | 属 | 假单胞菌属 | Pseudomonas | | 属 | 噬酸菌属 | Acidovorax | | 属 | 不动杆菌属 | Acinetobacter | | 属 | 鞘氨醇单胞菌属 | Sphingomonas | | 属 | 分枝杆菌属 | Mycobacterium | | 属 | 普氏菌属 | Prevotella | | 种 | 溶纤维丁酸弧菌 | Butyrivibrio fibrisolvens | | 种 | 蛋白溶解梭菌 | Clostridium proteoclasticum | | 种 | 金黄色葡萄球菌 | Staphylococcus aureus | | 种 | 青春双歧杆菌 | Bifidobacterium adolescentis | | 种 | 鼠李糖乳杆菌 | Lactobacillus rhamnosus | | 种 | 粪肠球菌 | Enterococcus faecalis | | 种 | 呀卟啉单胞菌 | Porphyromonas gingivalis | | 种 | 阴道加德纳菌 | Gardnerella vaginalis | | 种 | 鼠乳杆菌 | Lactobacillus murinus | | 种 | 解淀粉芽孢杆菌 | Bacillus amyloliquefaciens | | 种 | 芽孢杆菌 | Bacillus velezensis | | 种 | | Akkermansia muciniphila | | 种 | 酿酒酵母 | Saccharomyces cerevisiae | | 株 | 唾液链球菌 K12 | Saliva streptococcs |
2 qPCR的原理
实时荧光定量PCR技术（Real-timeQuantitativePCR，qPCR）是指在PCR反应体系中加入可与DNA产物特异性结合的荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最终通过相对定量（与内参基因对比）或绝对定量（通过标准曲线对未知模板进行定量）的方法确定各个样本的本底表达量。
3 3种荧光试剂的工作原理及区别
SYBRGreenⅠ法：
嵌入到双链DNA分子后在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后构象发生变化，能够吸收497nm的激发光并发出520nm的荧光；而不掺入DNA双链中的染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
TaqMan探针法：
扩增时加入一个特异性的寡核苷酸荧光探针，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5′-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步
SYBRGREEN法和TaqMan探针法的区别
| 方法 | 优点 | 缺点 | | SYBR
GREEN法 | 高灵敏度，操作简单，不影响酶促反应，价格便宜 | 1与探针法相比，对引物特异性要求较高，需进行熔解曲线分析
2灵敏度相对较低。 | | TaqMan
探针法 | 1具有高度特异性
2更高的灵敏度
3可同时检测几种不同的荧光信号的产物 | 1探针价格较高
2需要不同引物的扩增效率一致，对引物的设计及扩增条件要求比较高 |
4 qPCR的实验方法
4 qPCR的实验方法
| 实验方法 | 原理 | 技术应用 | 相关应用 | | 绝对定量(AbsoluteQuantification，AQ) | 是测定目的基因在样本中的分子数目，通过构建标准曲线对未知模板进行分子数目的定量，即通常所说的拷贝数。 | 特定微生物的拷贝数检测
特定功能基因的拷贝数检测
特定抗性基因的拷贝数检测 | 1临床疾病诊断
2动物疾病检测
3食品安全
4科学研究
5应用行业：各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。 | | 相对定量(RelativeQuantification，RQ) | 测定目的基因在样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的绝对拷贝数，一般是通过CT值之差来计算。 | 样本中某种特定微生物拷贝数占全部微生物拷贝数的比例
某种功能基因的微生物拷贝数占全部微生物拷贝数的比例
某种抗性基因拷贝数占全部微生物拷贝数的比例 |
相对定量和绝对定量的数据计算方法
每微升拷贝数（copies/μl）=[质粒浓度（ng/ul）×10-9×6.02×1023]/克隆产物相对分子质量
原始样本目标基因拷贝数copies/μLDNA=拷贝数*稀释倍数
原始样本目标基因拷贝数copies/g样本=（原始样本目标基因拷贝数copies/μLDNA*基因组DNA体积）/样本抽提重量，（如果客户样本为DNA样本，则不需要计算copies/g样本）
相对定量的计算：
步骤1:内参基因均一化样本差异：Ct目的基因–Ct内参基因=△Ct
步骤2:其他样本和对照样本比较：△Ct处理样本–△Ct对照样本=△△Ct
步骤3:使用公式计算：倍数变化=2-△△Ct
5 qPCR的实验流程
6 qPCR检测送样要求
| | 样本类型 | 样品量/例 | 备注 | | 环境 | 土壤/沉积物/淤泥 | 1g | | | 湖水/海水/河水 | 1L，用滤膜或离心富集 | 过 0.22μm 的滤膜，或者 12000rpm 离心，进行富集。 | | 污水 | 20ml | 若样本清亮则可适当地多取。 | | 泥水混合样 | 2ml | | | 空气 | 根据实验需要，用无菌滤膜过滤空气。 | | | 发酵物 | 固体 2g，液体 20ml | |
| | 样本类型 | 样品量/例 | 备注 | | 人体 | 粪便 | ≥3g | | | 皮肤 | 5 个采集拭子 | 采集 5cm*5cm 面积，反复刮取 20 次。 | | 生殖道 | 5 个采集拭子 | 采集阴道口内 4cm 处分泌物， 每个拭子转 3 圈。 | | 牙菌斑/舌苔 | 5 个采集拭子 | 在采集的部位，刮取 10 次左右。 | | 唾液 | 10ml | | | 痰液 | 10ml 或 2-3 口痰液 | | | 鼻腔 | 5 个采集拭子 | 采集鼻腔内粘膜上的分泌物，转 3 圈。 | | 肺部灌洗液 | 30ml 富集液 | 对灌洗液进行离心富集。 | | 肠道/胃组织 | 5mm*5mm*3mm
3 块 | 尽量多一取些。 | | 血液 | 3ml 全血 | 用 EDTA 抗凝管，颠倒 8-10 次。 不建议用肝素。 | | 尿液 | 30mL 尿液 | 取中段尿为宜。 | | 母乳 | 5mL | | | 动物 | 粪便 | ≥3g | 最少 0.05g。 | | 盲肠/结肠/胃
组织 | ≥3g | 至少 1g，如果实验条件允许，尽可能多的收集样本 | | 肠道内容物 | ≥3g | 最少 0.05g。建议客户自己取内容物，可以用 PBS 冲洗。 |
提醒
1 因为qPCR绝对定量最终得到的是单位重量，或是单位体积目标基因的拷贝数，所以如果客户送DNA，建议客户记录抽提DNA时样本的使用重量或是体积，方便后继对数据进行转化。
2 送样时请尽量使用冰盒（泡沫盒+干冰），以保证运输过程中的低温条件（干冰的挥发消耗量约为 3-4 公斤/天）。在打包时放入足量的干冰， 将样本埋入干冰中， 为了保持冰盒中的低温环境，建议采用加厚的泡沫盒
7 qPCR结果
标准曲线
扩增曲线
熔解曲线
定量结果
| 微基编号 | 拷贝数 | 样本稀释倍数 | 抽提样本重量（g） | 基因组DNA体积（μL） | 原始样本目标基因拷贝数copies/μL DNA | 原始样本目标基因平均拷贝数copies/μL DNA | 原始样本目标基因拷贝数copies/g样本 | 原始样本目标基因平均拷贝数copies/g样本 | | 1 | 1.08E+06 | 200 | 0.237 | 50 | 2.17E+08 | 2.26E+08 | 4.58E+10 | 4.76E+10 | | 1 | 1.23E+06 | 200 | 0.237 | 50 | 2.47E+08 | 5.20E+10 | | 1 | 1.07E+06 | 200 | 0.237 | 50 | 2.14E+08 | 4.51E+10 | | 2 | 7.28E+05 | 200 | 0.24 | 50 | 1.46E+08 | 1.49E+08 | 3.03E+10 | 3.09E+10 | | 2 | 7.55E+05 | 200 | 0.24 | 50 | 1.51E+08 | 3.15E+10 | | 2 | 7.44E+05 | 200 | 0.24 | 50 | 1.49E+08 | 3.10E+10 | | 3 | 1.24E+06 | 200 | 0.25 | 50 | 2.48E+08 | 2.59E+08 | 4.96E+10 | 5.19E+10 | | 3 | 1.35E+06 | 200 | 0.25 | 50 | 2.69E+08 | 5.39E+10 | | 3 | 1.30E+06 | 200 | 0.25 | 50 | 2.61E+08 | 5.21E+10 | | 4 | 1.61E+06 | 200 | 0.234 | 50 | 3.21E+08 | 3.22E+08 | 6.87E+10 | 6.87E+10 | | 4 | 1.60E+06 | 200 | 0.234 | 50 | 3.19E+08 | 6.82E+10 | | 4 | 1.62E+06 | 200 | 0.234 | 50 | 3.24E+08 | 6.93E+10 | | 5 | 1.27E+05 | 200 | 0.175 | 50 | 2.54E+07 | 2.66E+07 | 7.25E+09 | 7.59E+09 | | 5 | 1.33E+05 | 200 | 0.175 | 50 | 2.66E+07 | 7.61E+09 | | 5 | 1.39E+05 | 200 | 0.175 | 50 | 2.77E+07 | 7.91E+09 |
8 术语解释
Ct值（Cyclethreshold，循环阈值）：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。
荧光阈值（threshold）的设定：PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省（默认）设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold=10*SDcycle3-15
基线（baseline）：在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，即称为基线。
熔解曲线Tm（TmOfMeltingCurve）：SYBRGreen染料发实验结束后需对qPCR产物加热，随着温度的升高，双链接扩增产物逐渐解链，导致荧光强度下降，到达某一温度时，会导致大量的产物解链，荧光急剧下降，将此温度称为Tm值。不同PCR产物Tm值不同，从而可对PCR的特异性进行鉴定。
9 参考文献
1 Tristano Bacchetti De Gregoris et.al. Improvement of phylum- and class-specific primers for real-time PCR quantification of bacterial taxa.2011. Journal of Microbiological Methods.（厚壁菌门拟杆菌门alpha变形菌gamma变形菌等）
2 Baskar Balakrishnan et.al. Development of a real-time PCR method for quantification of Prevotella histicola from the gut.2017.Anaerobe.（普氏菌）
3 John Penders et.al. Quantification of Bifidobacterium spp., Escherichia coli and Clostridium difficile in faecal samples of breast-fed and formula-fed infants by real-time PCR.2005. FEMS Microbiology Letters.（双歧杆菌艰难梭菌大肠杆菌探针法）
4 Anders Bergstrom et.al. Introducing GUt Low-Density Array (GULDA) – a validated approach for qPCR-based intestinal microbial community analysis.2012. FEMS Microbiology Letters.（多种菌的定量）
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