利用qPCR研究环境中微生物数量

今天，基迪奥生物正式开工啦~

新的一年，新的征程，祝各位老师同学在新的一年取得新的成果！有没有人给小编发开工红包呀？不然点个赞也行啊~ 

在开工的第一天，给大家介绍一种利用qPCR对环境微生物进行绝对定量的方法。

qPCR（荧光定量PCR）实现了PCR技术从定性分析到定量分析的跨跃，同时这一技术具有敏感性强、特异性高、方便检测和安全快速等优点，目前已广泛应用于微生物生态学领域的研究中。

标准品制备

分别合成细菌、真菌和古菌特异性引物，引物序列如下：

表1. 引物序列

细菌、古菌和真菌qPCR分别采用从大肠杆菌DH5α中提取的细菌基因组DNA、红冬孢酵母YM25235（选用其他代表性菌株也可以）提取的真菌基因组DNA作为模板，使用相应的引物扩增样品中的目标片段（这一步扩增可以同时起到验证引物特异性，探索PCR条件的作用），1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，切胶回收，把目的片段克隆到pMD®18-T载体上。

使用T4连接酶将纯化后的目的片段与18-T在16°C过夜连接。然后10 μL连接产物加入100 μL感受态细胞中，冰浴30 min，42 °C热激30 s，立即冰上放置15-20min，加600 μLLB培养基，37 °C200-250 rpm振荡培养1小时，室温下4000 rpm离心5分钟，用枪头吸掉400 μL上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮，将细菌涂布在预先用20 μL100 mM IPTG和100 ml20 mg/ml X-gal涂布的氨苄青霉素平板上，平板在37 °C下正向放置1小时以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜，筛选阳性克隆并扩培。

图1 标准品制备方法示意图

标准曲线绘制

釆用生工质粒提取试剂盒提取质粒，通过分光光度计（Nanodrop, Germany）测定质粒DNA浓度，根据己知质粒浓度和阿伏伽德罗常数（6.02×10²³）计算出每微升提取的质粒中靶基因的拷贝数，将质粒10倍稀释后作为标准曲线的模板，90 μL稀释液+10 μL质粒，做6个点，通过预实验选取合适标准品用于制备标准曲线。

拷贝数的计算：

待测样本浓度（ng/ul）＝OD260×40×稀释倍数

样本分子量=碱基数×324

待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量×6.02×1014

细菌和古菌16S rRNA基因及真菌的ITS基因的定量试剂为Takara公司的SYBR® Premix Ex Taq TM试剂盒。利用荧光染料SYBRGreen I在双链DNA生成时嵌入到DNA分子内并发出可以检测的荧光来进行定量。PCR反应在ABI 7500（Applied Biosystem，美国）荧光定量PCR仪上进行。

PCR反应体系：SYBR Premix Ex Taq 10 μL，F引物0.4 μL，R引物0.4 μL，ROXDye 0.08 μL，DNA模板1 μL，H2O 8.12 μL；PCR反应程序：95°C预变性30 Sec；95°C变性5 Sec，60°C退火34 Sec（40个循环）。

在60°C延伸时检测荧光信号，标准曲线每个浓度梯度做三次平行重复，同时设置阴性对照。以标准质粒模板起始拷贝数为横坐标，荧光信号达设定阈值是所经历的循环数Ct值为纵坐标，绘制标准曲线，拟合线性方程，例如：

本例根据下面式子，计算微生物数量：

扩增效率（E）计算使用下面的式子：

 

在我的实际例子中：细菌扩增效率为98.6%，R^2为0.989；古菌扩增效率为97.3%，R^2为0.983；真菌的扩增效率为99.1%，R^2为0.996。

样品检测

参照标准曲线构建方法对12个土样DNA进行qPCR，每个土样设三个平行，阴性对照模板以超纯水替换。将检测到的Ct值平均后代入相应的标准曲线推算初始拷贝数，最后以基因拷贝数每克干土为单位进行分析，如下图。

今天的内容就到这里啦，欢迎大家交流讨论~

参考文献

[1]  Liu WT, Marsh TL, Cheng H, et al. Characterization of microbial diversity by determining terminalrestriction fragment length polymorphisms of genes encoding 16S rRNA[J]. Appliedand Environmental Microbiology, 1997, 63(11): 4516-4522.

[2]  Curlevski NJ, Xu Z, AndersoIC, et al.Soil fungal communities differ in native mixed forest and adjacent Araucaria cunninghamiiplantations in subtropical Australia [J].Journal of Soils and Sediments, 2010,10(7):1278-1288.