PCR定量与微流控技术

目前市场上的PCR产品主要是基于ABI开创的qPCR技术平台和荣研化学开创的LAMP技术平台，有的公司会在这两个技术平台的基础上进行研发创新，主要还是分成变温和恒温两大类，而对于PCR的定量功能实现这块，市场上的产品几乎都是基于qPCR平台实现对初始模板DNA分子的定量，但是如果将微流控芯片技术引入，PCR的定量就不局限于qPCR技术了~

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PCR定量的理论基础

1）PCR扩增原理视频

视频1：PCR扩增原理视频（来源【6】泛生子基因）

2）qPCR（实时荧光定量PCR）技术原理

实时荧光定量PCR技术主要通过两种方式——荧光染料或者荧光标记的探针对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，并结合相应的软件对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。

3）qPCR定量的数学理论模型

PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，成为定量的依据。

传统的qPCR通常以循环阈值( cycle threshold,CT)为定量分析的基础,认为在指数扩增的开始阶段样品间的细小误差尚未放大且扩增效率恒定。对于一个PCR反应，到达循环阈值时

其中，N₀为初始模板的拷贝数，N_t为第C_T个循环时产物的拷贝数，E为扩增效率。将上式两边取对数，得到

对于一个特定的PCR反应,扩增效率E和C_T个循环时的拷贝数N_t均为定值，因此C_T值与初始模板拷贝数N₀，的对数成反比关系^【5】。

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PCR如何实现定量

1）定量PCR的几种实现方式

定量PCR：以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数，称为定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行的，只有指数扩增时期，CT值与起始浓度的对数成线性关系，且该值具有重现性。

	绝对定量(数字PCR法)	绝对定量（标准曲线法)	相对定量
概述	使用数字PCR进行绝对定量时,无需已知的标准品。能够以数字PCR重复数确定的精确度对目标分子直接进行定量	使用标准曲线法进行绝对定量时,可以基于已知数量对未知数量进行定量。首先创建标准曲线:然后比较未知数量与标准曲线并推断出数值	在相对定量中,您可以分析特定样品相对于参考样品(比如,未处理的对照样品)某个基因表达量的变化
示例	确定异质混合物中存在的稀有等位基因拷贝数。以基因组DNA为靶标,统计样品中的细胞等价物的数量、确定指定样品中存在的病毒拷贝的绝对数量,而无需参考标准品	将病毒拷贝数与疾病状态建立关联	测量基因表达对药物的应答。在此示例中,您可以比较经化学处理样品中的特定目标基因的基因表达水平与未处理样品中的基因表达水平

表1：绝对定量与相对定量概述（来源：www.thermofisher.cn）

qPCR绝对定量和相对定量

1）绝对定量:精确的计算初始反应的模板浓度(DNA,RNA)。

2）相对定量:相对定量用于分析特定样品相对于参照样品（比如，未处理的对照组）某个基因表达量的变化。

qPCR绝对定量（标准曲线法）

图1：对初始模板进行定量分析（来源：先达基因官网）

qPCR相对定量

相对定量可根据从所有实时荧光定量 PCR 仪器获取的数据而进行。用于相对定量的计算方法有：标准曲线法和比较 CT 法。

相对定量是测定在测试样本中目标核酸片段与校对样本中同一序列片段的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。

图2：比较CT法示意图（图源：线上）

如图2实验样本和对照样本都有扩增曲线，都有相应的CT值，Ct值取决于阈值，阈值取决于基线，基线取决于实验的质量，Ct值是一个完全客观的参数。Ct值越小，模板DNA的起始拷贝数越多；Ct值越大，模板DNA的起始拷贝数越少。正常的CT值范围在18-30之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。PCR的理论扩增效率是2^Ct，所以实验样本相对于对照样本的扩增倍数就等于2^ΔCt（实验样本扩增曲线的CT值减去对照样本的CT值）。

数字 PCR 绝对定量

图3：数字 PCR 使用阳性（白色）与阴性（黑色）PCR 反应的比例来计算目标分子的数量（图源：www.thermofisher.cn）

如图3，数字PCR是一种核酸检测和定量分析的新方法，可以作为传统实时定量PCR的替代方法，以实现绝对定量及稀有等位基因的检测。数字PCR的工作原理在于将DNA或cDNA样品分割为许多单独、平行的PCR反应，部分这些反应包含了靶标分子（阳性），而其他不包含（阴性）。单个分子可以被扩增一百万倍或更多。在扩增期间，TaqMan化学试剂及染料标记探针可用于检测特定序列的靶标。当不存在任何靶标序列时，没有信号累积。PCR分析后，阴性反应片段用于生成样品中靶标分子的绝对计数，而无需标准品或内标^【1】。  

数字PCR的数学理论模型

与传统qPCR方法不同的是数字PCR采用直接计数的方法进行定量分析,也就是在PCR扩增结束后有荧光信号(产物)记为1,无荧光信号(产物)记为0,有荧光信号的反应单元中至少包含一个拷贝的目标分子。理论上,在样品中的目标DNA浓度极低的情况下,有荧光信号的反应单元数目等于目标DNA分子的拷贝数。但是,在通常情况下,数字PCR的反应单元中可能包含两个或两个以上的目标分子,这时可以采用泊松概率分布公式( Poissondistribution)进行计算。引用【5】数学模型公式：

n为反应单元总数,f为有荧光信号的反应单元数，m为样品溶液的稀释系数，c为样品的原始拷贝数(浓度)。由上数学公式，根据反应单元总数和有荧光信号的单元数以及样品的稀释系数，就可以得到样本的最初拷贝数( 浓度) 。

数字PCR的定量方法不依赖于扩增曲线的循环阈值,因此不受扩增效率的影响,也不必采用看家基因( housekeeping gene)和标准曲线,具有很好的准确度和重现性，可以实现绝对定量分析^【5】。

（拓展问题）LAMP等温扩增的核酸检测方法是否可以定量？

目前LAMP技术多用于定性实验，也可通过浊度仪检测副产物焦磷酸镁沉淀，从而间接达到基因定量的目的,该方法所需浊度仪应用范围较窄，且仪器成本高。但LAMP并不是不能实现定量，查线上的文献也发现有公司和科研机构在做LAMP的荧光定量研究，原理上还是基于染料或者探针的荧光信号和扩增产物呈现一定的数学关系而对样本中的核酸分子进行定量或者粗定量，感兴趣的朋友可以学习文末参考项的【7】和【8】。

但是LAMP法如果应用到数字PCR的液滴或者微流控芯片的微腔中，那也可以绝对定量，毕竟数字PCR定量不需要做标准曲线。

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微流控技术对于实现PCR的定量有什么优势？

微流控芯片相比较孔板这类传统耗材有着微型化、自动化、多通量、极小样本体积（数字PCR可达皮升级）以及密闭性的优点，这也是为什么市场上的大多数POCT产品都免不了需要往微流控方向发展。对于PCR的定量功能实现，微流控技术会使得PCR定量的实现更加直观直接。

图4: DiaSorin 96 well Universal Disc（图片源：DiaSorin官网）

图5：几种典型数字 PCR 芯片:  a) 微反应室 /孔板数字PCR( OpenArray^TM)；b) 大规模集成微流控数字 PCR芯片( BioMark^TM);  c) 微液滴数字 PCR( QX100^TM)（来源：【5】）