为进一步提高《微生物组实验手册》稿件质量,本项目新增大众评审环节。文章在通过同行评审后,采用公众号推送方式分享全文,任何人均可在线提交修改意见。公众号格式显示略有问题,建议电脑端点击文末阅读原文下载PDF审稿。在线文档(https:///l/cL8RRqHIL)大众评审页面登记姓名、单位和行号索引的修改建议。修改意见的征集截止时间为推文发布后的72小时,文章将会结合有建设性的修改意见进一步修改后获得DOI在线发表,同时根据贡献程度列为审稿人或致谢。感谢广大同行提出宝贵意见。 小鼠粪便样本中16S拷贝数的定量检测 Quantitative Analysis of 16S rRNA Gene Copies in Mouse Fecal Sample 刘红宾1*,吕青青1,戴磊1 1.中国科学院深圳先进技术研究院,深圳,广东省 *通讯作者邮箱:binhongliu@126.com 摘要:16S rRNA基因和宏基因组测序技术是研究肠道菌群结构与功能的重要手段,由此可以获取微生物群落的结构和功能组成信息;然而,二者得到的数据均为相对丰度类型,大大削弱了不同样品间的可比性,也难以揭示生物量水平的菌群结构和功能变化。本文旨在运用实时荧光定量PCR技术(Real-time PCR)技术对小鼠粪便中的16S rRNA基因进行定量检测,为准确分析肠道菌群的结构提供技术参考。 关键词:16S rRNA基因,绝对定量,肠道菌群 材料与试剂试剂: 1.高保真酶(PrimeSTAR,TAKARA,R045A) 2.TB Green酶(TAKARA,RR820A) 3.Omega胶回收试剂盒(Omega,D2500-01) 4.琼脂糖 5.引物(27F-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG,1541R-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA ;331F-TCCTACGGGAGGCAGCAGT,797R-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT)[1] 仪器设备 1.Nanodrop 2000 2.电泳仪 3.普通PCR仪(Bio-read) 4.荧光定量PCR仪(Bio-read) 实验步骤A.全长16S rRNA基因标准品制备 1.全长16S rRNA基因扩增 PCR扩增体系:
PCR扩增程序(30个循环):
2.全长16S rRNA基因扩增产物回收 按照胶回收试剂盒说明书,对PCR扩增产物进行回收,并利用Nanodrop对其浓度进行测定。 3.全长16S rRNA基因扩增产物拷贝数确定 举例:Nanodrop测得胶回收的16S片段的浓度为182 ng/μl,由于1,500 bp的16S核酸的分子量为5.1 x 105 ng/nmol(https://www./conversion.html),所以标准品中含有3.57 x 10-4 nmol分子,根据阿伏伽德罗常数计算1 μl标准品中含有2.14 x 1011个拷贝。 4.全长16S rRNA基因扩增产物梯度稀释 将标准品做10倍系列稀释, 使其形成109-104拷贝/μl。 B.16S rRNA基因拷贝数标准曲线的制备 1.全长16S rRNA基因梯度拷贝数标准品的定量PCR检测 Real-time PCR扩增体系:
PCR扩增程序(40个循环):
2.构建16S rRNA基因梯度拷贝数标准曲线 以不同拷贝数的阳性模板的对数为横坐标, 以PCR反应过程中到达荧光阈值的初始循环数(Ct)为纵坐标得到标准曲线, 为待测样品的定量提供了定量检测的参照标准. C.小鼠粪便DNA待测样品中16S rRNA基因拷贝数的定量检测 对小鼠粪便DNA待测样品,按照“全长16S rRNA基因梯度拷贝数标准品的定量PCR检测”中的程序与条件,进行real-time PCR检测。依据建立的标准曲线,计算出待测样品中的16S rRNA基因拷贝数。 结果与分析下图1展示了溶解曲线、标准曲线和待测样品的检测结果。依据标准曲线方程,Ct值为8的小鼠粪便DNA样品中含有的16S rRNA基因拷贝数为10^(-0.2819 x 8 + 10.682)= 2.67 × 108个。 图1. RT-PCR方法检测粪便样本中微生物16S rRNA基因拷贝数熔解曲线和标准曲线 参考文献1.Jian, C., Luukkonen, P., Yki-Jarvinen, H., Salonen, A. and Korpela, K. (2020). Quantitative PCR provides a simple and accessible method for quantitative microbiota profiling. PLoS One 15(1): e0227285. |
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