| 【摘要】：背景与目的 Scorpions ARMS EGFR基因突变检测试剂盒,是目前公认检测EGFR基因突变最为敏感的方法之一,其检测灵敏性可达10copies,敏感性高达1%。此外它还具有操作简便、结果判读容易、省时、检测突变种类多等优点,但唯一缺点是价格昂贵,不适合象中国这种发展中国家NSCLC患者的常规检测和筛查。因此,本研究拟采用ARMS技术与Taqman探针相结合的方法,研发一种拥有完全自主知识产权并且能够快速、敏感、特异、简便检测EGFR基因突变的试剂盒。 Scorpions ARMS试剂盒ARMS引物设计是将3’端设计在突变位点,最后一个碱基与突变碱基配对,只有引物3’末端完全配对时,才能正常扩增,当引物3’末端发生错配时,不能有效扩增。但是对于替换突变,如T790M,在使用ARMS引物时,由于野生型与突变型只有一个碱基的差别,当野生型模板含量高时,可能发生无效的引物结合,由此产生非特异性扩增,导致检测出现假阳性结果。因此,我们拟重新设计ARMS引物,在引物的3’端再人为引入一个错配碱基,这样对野生型模板即有两个错配碱基,可大大提高特异性,而对突变型模板只有一个错配碱基,且不在3’末端,通过反复实验筛选,最终确定与突变模板具有高结合效率的引物,同时不影响检测灵敏度。 方法 ①采用重叠延伸PCR法联合质粒连接、转化构建EFGR基因29种常见突变体(包括18外显子的3种突变G719A、G719S、G719C;19外显子的19种缺失突变；20外显子的5种突变T790M、S768I和3种插入突变；21外显子的2种突变L858R和L861Q,共29种)。 ②应用Primer Express3.0软件设计EGFR基因29种常见突变的ARMS特异性引物以及用于目的序列检测的Taqman水解探针,通过反复实验筛选并确定最终的ARMS引物和Taqman探针,并优化反应体系,建立试剂盒。然后,以所构建的基因突变体为研究对象,进一步分析该试剂盒的检测灵敏度、敏感性以及确立特异性和非特异性扩增的Cutoff△Ct值。 ③采用Taqman ARMS试剂盒检测100份NSCLC组织标本。基中有29份标本,曾采用Scorpions ARMS试剂盒检测过EGFR基因突变,通过比较这两种方法检测结果的差异,来评价这两种方法检测一致性。 结果 ①采用重叠延伸PCR法能够对EGFR基因实施定点突变,联合质粒连接和DH5a感受态细胞转导能够成功重建29种常见的EGFR基因突变体。 ②最终筛选和确定的ARMS引物和Taqman探针见第二部分表3。在无野生型基因以及背景DNA干扰的情况下,本试剂盒的检测灵敏度可达10copies。对于检测敏感性方面,在500copies/ul野生型基因背景下,其敏感性达1%,即混有1%突变基因即可检出；在5000copies/ul野生型基因背景下,其敏感性高达0.1-0.5%。对于检测特异性方面,以正常人白细胞DNA (1-50ng/ul)为研究对象,T790M和21L858R突变存在一定程度的非特异性扩增,但其最小△CT (CT非特异-CT内参)仍分别高达11.36和14.89,而其他的突变G719X、19Del、20Ins、L861Q、 S768I均未见非特异性扩增。 ③100份临床标本,Taqman ARMS试剂盒检出19Del21例,21L858R18例,20Ins1例,G719X1例,总突变率为41.0(41/100)。从EGFR基因突变分布看,19Del占51.2%(21/41),21L858R占43.9%(18/41),20Ins占2.4%(1/41),G719X占2.4%(1/41),末检出T790M突变。其中29份标本分别采用了Scorpions ARMS和Taqman ARMS进行检测,两种方法对19Del突变检出一致率为93.1%, Kappa值为0.627；对21L858R突变检出一致率高达96.6%, Kappa值为0.890,两种方法具有较高的一致性。 结论 我们所设计的Taqman ARMS荧光定量PCR,试剂盒是一种快速、简便、经济以及具有较高灵敏度和特异性的EGFR基因突变检测方法,值得在临床上进一步验证和推广。 |
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