作者：中山大学附属第一医院脊柱外科 钟锐
腰椎间盘退变（IVD）和突出被认为是导致腰痛（lowbackpain）的主要原因。建立动物模型为研究腰椎间盘退变机制和试验新治疗方案提供了一个良好的途径。目前构建腰椎间盘退变动物模型的方法主要分为自然诱发和实验诱发两种。在模型构建后的评价方法多种多样，主要包括影像学、组织形态学和分子生物学评估。笔者对腰椎间盘退变模型建立后的退变评价方法综述如下。
影像学评价方法
X线片评价
腰椎间盘退变时X线片上表现为椎间隙变窄、椎体楔形变、终板钙化、边缘骨赘生长等，其中最具特征性的改变为椎间隙高度变窄。Gruber等对158只沙鼠和22只沙鼠分别进行横断面和纵向研究，结果显示沙鼠2月龄时X线片上即出现腰椎间盘退变征象，而且在老龄沙鼠腰椎X线片上可见椎体楔形变、椎间隙变窄、终板硬化等与人类腰椎间盘退变时相同的X线表现。Lauerman等对狒狒的腰椎行X线片检查，结果显示狒狒随着年龄的增长，腰椎间盘出现退变的X线征象及后凸角改变。沙鼠和狒狒都是自然诱发退变模型，但由于动物种属之间腰椎间盘解剖形态、生化组成等有较大差异，并非所有的种属都能自然诱发椎间盘退变。因此实验诱发退变模型成为目前普遍使用的方法。
为了能更加客观地定量评价腰椎间盘退变程度，Kim等在侧位X线片上用5条标记线将新西兰兔腰椎间隙高度均分为四等分，并取中间3条标记线的均值作为椎间隙高度进行定量分析以评价椎间盘退变的程度。Masuda等采用椎间高度指数（DHI）来定量分析腰椎间盘退变的程度，他们通过测量兔腰椎侧位X线图像上目标椎间隙的前侧、中间、后侧高度的均值，以及相邻上下两椎体高度的均值，并将两者的比值作为DHI（图1），用于进行定量比较分析。
MRI评价
MRI可以清晰显示腰椎间盘中软组织影像，T2加权像信号高低与椎间盘髓核中水分含量密切相关，因而可以更加早期准确地评估椎间盘的退变。Pfirrmann等根据腰椎间盘退变时髓核、纤维环MRIT2加权像信号高低及椎间高度提出了Pfirrmann分级标准，将椎间盘退变程度分成Ⅰ~Ⅴ级，尽管这一标准是针对人腰椎间盘制定的，但已经在很多动物模型证明也适用。
还有学者提出，用MRI指数来定量评价腰椎间盘退变程度，同样是在MRIT2加权图像上，将髓核面积与相对应信号强度的乘积作为MRI指数，结果显示兔腰椎经椎间盘穿刺损伤后的MRI指数较对照组明显降低。MRI中旋转坐标系下的纵向弛豫（T1ρ）扫描序列可以发现组织中蛋白聚糖的变化，而早期腰椎间盘退变发生的最主要生化改变即是髓核中蛋白聚糖和水分的减少，因而T1ρ值可以间接反映早期椎间盘退变发生的生化改变。近来有学者的研究证实在人和恒河猴中T1ρ值与Pfirrmann分级之间均具有显著相关性（图2），进一步证实T1ρ值可以用来定量评估腰椎间盘退变程度。
Micro-CT评价
终板功能的异常被认为是椎间盘退变重要的原因之一。生物力学上，终板必须足够坚硬，能够抵抗破坏以便均匀一致地将载荷传到椎间盘，就算是轻微的终板损伤都会破坏椎间盘压力的均匀分布，异常分布的压力会抑制椎间盘细胞的新陈代谢，加速细胞基质的退变，因而终板的损伤可能会开启腰椎间盘的退变过程。其次，终板必须具有足够的通透性以利于能量物质、氧气以及乳酸等代谢废物进出椎间盘细胞。
椎间盘血供主要由贯穿终板软骨下骨的毛细血管床提供，一小部分通过纤维环周围的毛细血管提供，在退变椎间盘中血管的数量和管径都将减少；软骨下骨的改变早在腰椎间盘退变Ⅱ期就被发现，提示终板软骨下骨的改变与椎间盘的早期退变相关。Micro-CT可以通过超薄层扫描椎体终板和软骨下骨的微观结构以及重建终板的外形和其中穿行的血管网络，因而可以反映椎间盘退变时终板等骨组织的改变，间接评价腰椎间盘退变的情况。
Hee等通过对实验组新西兰大白兔腰椎轴向加压，并用Micro-CT重建加压28d后终板血管网情况，结果显示与对照组相比实验组终板血管网络明显减少，并显示终板的血管网络是个复杂的分支交错的三维网络结构（图3）。Gruber等对大鼠腰椎进行Micro-CT扫描后发现老龄大鼠腰椎终板较幼龄大鼠粗糙，并在表面出现凹陷，终板边缘也变得不规则，并据此制定终板评价的评分标准以定量评价退变情况，（1）终板表面光滑度：光滑0分；粗糙1分；非常粗糙并有凹陷出现2分。（2）终板边缘特征：正常0分；边缘早期不规则改变1分；边缘非常粗糙、不规则2分。尽管Micro-CT已经应用于中小型动物模型的评价中，但其是否适用于大型四足动物如犬、羊等还有待进一步研究。
组织形态学评价方法
组织学主要是通过HE染色和其他不同的特殊染色对腰椎间盘组织进行评价分析，它是目前评价腰椎间盘退变最准确的方法，而在临床中病理诊断也是金标准。腰椎间盘退变时，髓核、纤维环和软骨终板都会发生相应的病理改变。
Luo等在研究阿仑膦酸钠治疗腰椎间盘退变的作用时，用大鼠建立腰椎退变模型后，取椎间盘组织进行HE染色观察，结果显示单纯退变组髓核中脊索细胞减少，软骨样细胞增加，髓核粘液样变，裂隙形成，髓核纤维环边界不清；纤维环排列紊乱，半环同心圆结构破坏，纤维细胞减少；软骨终板不规则，边缘出现骨赘、钙化等；而对照组和阿仑膦酸钠治疗组中椎间盘组织没有明显的退变征象。
虽然成人髓核中并不含脊索细胞，但在同样不含脊索细胞的山羊中，Zhou等通过向山羊腰椎间盘中注射核苷诱导退变，在其病理组织切片中同样观察到类似大鼠的退变改变：髓核细胞数减少，纤维软骨组织增加，髓核纤维环边界不清，纤维环排列紊乱等。
由于单纯的HE染色并不能很好地区分腰椎间盘中蛋白聚糖、胶原、软骨等成分的变化，因而辅以一些特殊的染色，将能更好地评价腰椎间盘的退变情况。常用的特殊染色有collagenvanGieson（VG染色）。Luo等在进行大鼠腰椎间盘退变研究时提出，将标本行VG染色后根据髓核、纤维环、骨质增生情况进行量化评分（表1）。腰椎间盘基质主要由胶原蛋白和蛋白聚糖组成，Gruber等据此对椎间盘标本采用Alcianblue/Picrosiriusred染色，Alcianblue能将蛋白聚糖（proteoglycans）染成蓝色，Picrosiriusred能将胶原染成红色，因此可以在同一张病理片上清晰显示椎间盘中蛋白聚糖和胶原变化情况。
SafraninO染色可以将髓核细胞中蛋白聚糖和软骨终板染成红色，能够直观地反映腰椎间盘退变时蛋白聚糖及软骨终板的改变。Masson染色将胶原纤维染成蓝色，主要用于评估腰椎间盘纤维环的组织学变化情况。软骨终板中管芽对腰椎间盘细胞的营养意义重大。
有学者通过观察HE染色下软骨终板中血管沟数量和面积百分比来评价椎间盘退变情况。还有学者对新西兰兔腰椎施加额外轴向压力28d后，在取材前向实验动物静脉注射血管示踪剂荧光素钠水，并让其体内循环5min，取材后在荧光显微镜下观察终板血管变化情况。椎间隙高度减少是腰椎间盘退变的一个重要表现，除了影像学测量外，在病理组织切片上同样可以测量实验动物椎间盘高度。Allon等在小鼠腰椎间盘的组织切片上通过测量前、中、后三处生长板间的距离，取其平均值来表示椎间盘的高度，可以较影像学更精准地通过椎间隙高度变化情况评价退变程度。
分子生物学评价方法
免疫组织化学和定量PCR是主要的分子生物学评价方法。免疫组化能够定性、定量反映腰椎间盘退变模型动物中发生的生物化学变化，而定量PCR可以进一步检测这些生物化学改变的基因表达情况。尽管腰椎间盘退变的机制尚不明确，但有学者研究认为其退变过程某种程度上是椎间盘细胞外基质代谢功能的异常所致。
细胞外基质代谢功能受到代谢水解酶的影响，其中最主要的是基质蛋白酶（MMPS）和蛋白聚糖酶（ADAMTS）两大家族，MMPS通过水解细胞外基质特别是胶原参与到腰椎间盘退变过程中，MMP-1和MMP-13可以裂解Ⅱ型胶原的螺旋结构，MMP-3不仅可以降解蛋白多糖、纤维蛋白等，还能激活MMP-1和MMP-13的前体。有学者在大鼠和山羊椎间盘退变模型中均证实这些MMPS在退变椎间盘中明显增加。ADAMTS-5的mRNA和蛋白在动物和人退变椎间盘中都有发现，有学者的研究也证实ADAMTS-5参与到腰椎间盘退变的过程中，并在退变髓核中表达增高。在腰椎间盘退变时主要表现为Ⅱ型胶原（主要存在于髓核）的下降和Ⅰ型胶原（主要存在于纤维环）的增加，Ⅹ型胶原也被报道与椎间盘退变相关，特别是有研究表明其与软骨终板的钙化相关，在高龄小鼠中发现Ⅹ型胶原的阳性表达较低龄小鼠增加，而Ⅱ型胶原表达减少。
羟脯氨酸测定可以评估腰椎间盘中总胶原含量，应用氯亚明和二甲氨基苯甲醛的比色法测定总胶原含量后，可直接定量评价退变情况。腰椎间盘退变最具特征性的生化改变是蛋白聚糖（aggrecan）的减少。Kwon等的研究显示，兔退变的腰椎间盘中蛋白聚糖的阳性表达较对照组明显减低。SOX-9为软骨细胞转录因子，主要存在于软骨样细胞中，腰椎间盘退变晚期，髓核细胞逐渐被软骨样细胞和纤维组织所替代，因而通过检测其表达情况可以评估椎间盘退变。Keorochana等对鼠椎间盘退变进行免疫组化研究，结果也证实SOX-9主要在髓核和髓核纤维环交界处表达，其阳性表达随着退变的进展而增强。因而通过对蛋白聚糖、胶原和代谢水解酶的分子生物学检测，可以直观反应腰椎间盘在退变时所发生的生物化学改变，从而评估椎间盘退变模型构建是否成功，以及评价腰椎间盘退变治疗干预效果。
其他评价方法
腰椎间盘退变时，髓核和纤维环细胞逐渐凋亡衰老，Wang等在研究吸烟对小鼠椎间盘退变影响时，用TUNEL检测纤维环中凋亡细胞，并用P16INK4a标记髓核中衰老细胞，结果显示吸烟组中小鼠细胞凋亡和衰老率均较对照组高。Farndale等将髓核湿重和干重（60°干燥12h）进行测量，计算得出髓核水分的重量，随后将髓核样本在60°环境用木瓜蛋白酶消化12h，然后与参照物在1，9-二甲基亚甲基蓝中共培养后测量其在525nm波长时的光密度值，以定量分析糖胺聚糖含量，通过定量分析髓核中的水和胺聚糖含量来评估腰椎间盘退变情况。
Vialle等建立了一种组织形态学分析标准来评估退变椎间盘，他们的研究中通过比较新西兰兔正常和退变腰椎间盘髓核中细胞的平均面积和总面积、细胞浆的平均面积和总面积，总的细胞核面积，结果显示退变组髓核中细胞的平均面积和总面积、细胞浆的平均面积和总面积、总的细胞核面积均较正常组低，而平均细胞核面积两者间无明显差异，因而他们认为这一组织形态学指标可以准确、客观地区分退变和正常椎间盘组织，而且可重复好，是一种可靠的评价腰椎间盘退变的方法。
总之，影像学评价腰椎间盘退变模型具有无创、方便等优点，MRI可以发现早期退变椎间盘，但其只能间接反映椎间盘退变情况，而且MRI和Micro-CT检查价格昂贵也限制了其应用；生物化学评价可以直观反映腰椎间盘退变时发生的生理生化改变，但同样有不同种属间测量指标变化范围大的不足。尽管组织学是评价腰椎间盘退变的金标准，但不同的人在制备和观察标本时所得到的结果可能不同。
目前临床上主要通过MRI和病理观察评价腰椎间盘退变情况，如果能比较分析动物和人腰椎间盘退变标本在影像学、生物化学和组织学中的相似点，例如椎间隙高度降低、髓核细胞数减少、蛋白聚糖表达下降等共性，联合这些共性建立一种客观敏感的评价体系，将有助于对腰椎间盘退变发病机制的认识，增加治疗腰椎间盘退变相关研究的可靠性。
来源：中国脊柱脊髓杂志2014年第24卷第11期
