本文总结了毕赤酵母表达常用的一些载体 以及14种毕赤酵母表达所用培养基，即：LB(Luria-Bertani)培养基、LLB(Low Salt LB)培养基、 YPD (又称YEPD)、BMGY培养基、BMMY培养基、YPDS + Zeocin 培养基、最小甘油培养基(MGY)、葡萄糖再生培养基（RD)等。 一、毕赤酵母表达常用载体 ： 典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶-1(AOX1)基因的启动子和转录终止子(5'AOX1和3'AOX1)，它们被多克隆位点(MCS)分开，外源基因可以在此插入。此载体还包含组氨醇脱氢酶基因(HIS4)选择标记及3'AOX1区。当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组 ，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ， pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。工程菌株Y11430，MG1003，GS115 (AOX1)，KM71，SMD1168。毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut+，即甲醇利用正常型;而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。多拷贝表达菌株的获得方式： 与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入;而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。得到产量高的表达菌株。另一种在转化前将多个表达盒拷贝插入到单个载体中，而后再通过交换整合到受体染色体上。表达蛋白纯化方法： 酵母系统表达的蛋白一般都具有活性，所以都采用较温和的纯化方式来纯化目的蛋白，分泌型表达的蛋白有利于纯化，可用硫酸铵沉淀，然后用离子交换，凝胶过滤层析，疏水层析等方法进一步纯化。具体的方法和操作应按所处理的目的蛋白的性质选择。 二.毕赤酵母表达的培养基配制和用途 2.1 LB(Luria-Bertani)培养基： Trypton l% Yeast Extract 0.5% NaCl l% PH 7.0 制作平板时加入 2%琼脂 粉。121℃高压灭菌 20min。可于室温保存。用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin 25ug / ml。 2.2 LLB(Low Salt LB)培养基： Trypton l% Yeast Extract 0.5% NaCl 0.5% PH 7.0 制作平板时加入 2%琼脂 粉。121℃高压灭菌 20min。可于室温保存数月。用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时，加入Zeocin 25ug / ml，可以4℃条件下保存1～2周. 2.3 YPD (又称YEPD) Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基) Trypton 2% dextrose (glucose) 2% +agar 2% +Zeocin 100 μg/ml 液体YPD培养基可常温保存,是毕赤酵母的最基本培养基，琼脂YPD平板在4℃可保存几个月。加入Zeocin 100ug / ml，成为YPDZ培养基，可以4℃条件下保存1～2周。 2.4 BMGY培养基 Yeast extract 1% Peptone 2% 磷酸钾缓冲液(pH6.0)100mmol/L YNB 1.34% Biotin (4×10 -5 )% Glycerol 1% 毕赤酵母诱导表达前培养基，YNB和Biotin过滤除菌。培养24小时后，一般静置过夜，待酵母沉淀后倒掉BMGY培养基，改换BMMY培养基，进入诱导表达阶段。 2.5 BMMY培养基 Yeast extract 1% Peptone 2% 磷酸钾缓冲液(pH6.0)100mmol/L YNB 1.34% Biotin (4×10 -5 )% methanol 3% 毕赤酵母诱导表达培养基，YNB和Biotion过滤除菌。摇瓶培养时每24小时之后加入3%的甲醇诱导，一般诱导72小时。 2.6 YPDS + Zeocin 培养基(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)： yeast extract 1% peptone 2% dextrose (glucose) 2% sorbitol 1 M +agar 2% + Zeocin 100 μg/ml 不管是液体YPDS培养基，还是YPDS + Zeocin 培养基，都必须存放4℃条件下，有效期1～2周。 2.7 MGY Minimal Glycerol Medium (最小甘油培养基) (34%YNB;1%甘油;4*10-5%生物素)。将800ml灭菌水、100ml的10*YNB母液、2ml的500*B母液和100ml的10*GY母液混匀即可，4℃保存，保存期为2个月。 2.8 MGYH Minimal Glycerol Medium + Histidine (最小甘油培养基 + 0.004%组氨酸) 在1000ml的MGY培养基中加入10ml的100*H母液混匀，4℃保存，保存期为2个月。 2.9 RD Regeneration Dextrose Medium (葡萄糖再生培养基) (含有：1mol/L的山梨醇;2%葡萄糖;1.34%YNB;4*10-5%生物素;0.005%氨基酸) 1. 将186g的山梨醇定容至700ml，高压灭菌; 2. 冷却后于45℃水浴; 3. 将100ml的10*D、100ml的10*YNB;2ml的500*B;10ml的100*AA等母液和88ml无菌水混匀，预热至45℃后，与步骤2的山梨醇溶液混合。4℃保存。 2.10 RDH Regeneration Dextrose Medium + Histidine (葡萄糖再生培养基 + 0.004%组氨酸) 在RD培养基配制的第三步中，在加入10ml的100*H母液，同时无菌水的体积减少至78ml即可，其余配制方法与RD相同。4℃保存。 2.11 RD及RDH平板的制备 1. 将186g的山梨醇和15~20g琼脂粉定容至700ml，高压灭菌;冷却后于60℃水浴; 2. 参照RD/RDH液体培养基配制的步骤4，将100ml的10*D、100ml的10*YNB;2ml的500*B;10ml的100*AA等母液、(10ml的100*H母液)和88(78)ml无菌水混匀，预热至45℃后，与步骤1的山梨醇/琼脂液混匀; 3. 迅速制备平板。4℃可保存数月。 2.12 RD及RDH 的TOP 琼脂的制备(常用于酵母菌的包被) 1.将186g的山梨醇和7.5~10g琼脂粉定容至700ml，高压灭菌;冷却后于60℃水浴; 2.参照RD/RDH液体培养基配制的步骤4，将100ml的10*D、100ml的10*YNB;2ml的500*B;10ml的100*AA等母液、(10ml的100*H母液)和88(78)ml无菌水混匀，预热至45℃后，与步骤1的山梨醇/琼脂液混匀; 3.将该TOP琼脂置于45℃水浴冷却、保温，备用。 2.13 MD与MDH Minimal Dextrose Medium +(Histidine) 最小葡萄糖培养基 +( 0.004 %组氨酸) (含有：1.34%YNB;;4*10-5% 生物素;2%葡萄糖) 1. 100ml的10*YNB;2ml的500*B和100ml10*D母液，用800ml的无菌水定容至1000ml即可; 2. 如配制MDH，可在上述的MD中加入10ml的100*H即可; 3. 如配制平板，可无菌水的灭菌前，加入15~20g的琼脂。4℃可保存数月。 2.14 SOC培养基： Trypton l% Yeast Extract 0.5% NaCl 0.05% Glucose (1mol / L) 2% 121℃高压灭菌 20min，冷却后，4℃保存。 母液的配置注： 10*YNB (含有硫酸铵、无氨基酸的13.4%酵母基础氮源培养基) 4℃保存。34g酵母基础氮源培养基(无硫酸铵)+100g硫酸铵，溶于1000ml水中，过滤除菌。 500*B (0.02%生物素 Biotin) 4℃保存 保存期为1年。20mg的生物素溶于100ml水中，过滤除菌。 100*H (0.4%Histidine 组氨酸) 4℃保存 保存期为1年。400mg的L-组氨酸溶于100ml水中，(加热至50℃以促进溶解)，过滤除菌。 10*D (20%Dextrose 葡萄糖) 保存期为1年。200g葡萄糖溶于1000ml水中，灭菌15min或过滤除菌。 10*M (5%Methanol 甲醇) 保存期为2个月。将5ml的甲醇与95ml水混匀，过滤除菌。 10*GY (10%Glycerol 甘油)保存期为1年以上。将100ml甘油和900ml水混匀后，高压灭菌或过滤除菌。 100*AA (0.5% of each Amino Acid，各种氨基酸) 4℃保存 保存期为1年。分别将500mg的L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸溶于100ml水中，过滤除菌。 1M 磷酸钾溶液(potassium phosphate buffer，pH6.0)，将1mol/L的K2HPO4溶液132ml与1mol/L的KH2PO4溶液868ml混匀，其pH为6.0，如需调节pH，则使用磷酸和氢氧化钾调节pH。 培养基母液配制好了，均要在4℃保存，如果出现沉淀、白色絮状物质等，有可能是溶液配制不恰当产生了沉淀（可能是水质问题等）、母液被菌类污染等，一定要重新配置溶液。
本文总结了毕赤酵母表达常用的一些载体 以及14种毕赤酵母表达所用培养基，即：LB(Luria-Bertani)培养基、LLB(Low Salt LB)培养基、 YPD (又称YEPD)、BMGY培养基、BMMY培养基、YPDS + Zeocin 培养基、最小甘油培养基(MGY)、葡萄糖再生培养基（RD)等。 一、毕赤酵母表达常用载体 ： 典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶-1(AOX1)基因的启动子和转录终止子(5'AOX1和3'AOX1)，它们被多克隆位点(MCS)分开，外源基因可以在此插入。此载体还包含组氨醇脱氢酶基因(HIS4)选择标记及3'AOX1区。当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组 ，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ， pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。工程菌株Y11430，MG1003，GS115 (AOX1)，KM71，SMD1168。毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut+，即甲醇利用正常型;而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。多拷贝表达菌株的获得方式： 与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入;而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。得到产量高的表达菌株。另一种在转化前将多个表达盒拷贝插入到单个载体中，而后再通过交换整合到受体染色体上。表达蛋白纯化方法： 酵母系统表达的蛋白一般都具有活性，所以都采用较温和的纯化方式来纯化目的蛋白，分泌型表达的蛋白有利于纯化，可用硫酸铵沉淀，然后用离子交换，凝胶过滤层析，疏水层析等方法进一步纯化。具体的方法和操作应按所处理的目的蛋白的性质选择。 二.毕赤酵母表达的培养基配制和用途 2.1 LB(Luria-Bertani)培养基： Trypton l% Yeast Extract 0.5% NaCl l% PH 7.0 制作平板时加入 2%琼脂 粉。121℃高压灭菌 20min。可于室温保存。用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin 25ug / ml。 2.2 LLB(Low Salt LB)培养基： Trypton l% Yeast Extract 0.5% NaCl 0.5% PH 7.0 制作平板时加入 2%琼脂 粉。121℃高压灭菌 20min。可于室温保存数月。用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时，加入Zeocin 25ug / ml，可以4℃条件下保存1～2周. 2.3 YPD (又称YEPD) Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基) Trypton 2% dextrose (glucose) 2% +agar 2% +Zeocin 100 μg/ml 液体YPD培养基可常温保存,是毕赤酵母的最基本培养基，琼脂YPD平板在4℃可保存几个月。加入Zeocin 100ug / ml，成为YPDZ培养基，可以4℃条件下保存1～2周。 2.4 BMGY培养基 Yeast extract 1% Peptone 2% 磷酸钾缓冲液(pH6.0)100mmol/L YNB 1.34% Biotin (4×10 -5 )% Glycerol 1% 毕赤酵母诱导表达前培养基，YNB和Biotin过滤除菌。培养24小时后，一般静置过夜，待酵母沉淀后倒掉BMGY培养基，改换BMMY培养基，进入诱导表达阶段。 2.5 BMMY培养基 Yeast extract 1% Peptone 2% 磷酸钾缓冲液(pH6.0)100mmol/L YNB 1.34% Biotin (4×10 -5 )% methanol 3% 毕赤酵母诱导表达培养基，YNB和Biotion过滤除菌。摇瓶培养时每24小时之后加入3%的甲醇诱导，一般诱导72小时。 2.6 YPDS + Zeocin 培养基(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)： yeast extract 1% peptone 2% dextrose (glucose) 2% sorbitol 1 M +agar 2% + Zeocin 100 μg/ml 不管是液体YPDS培养基，还是YPDS + Zeocin 培养基，都必须存放4℃条件下，有效期1～2周。 2.7 MGY Minimal Glycerol Medium (最小甘油培养基) (34%YNB;1%甘油;4*10-5%生物素)。将800ml灭菌水、100ml的10*YNB母液、2ml的500*B母液和100ml的10*GY母液混匀即可，4℃保存，保存期为2个月。 2.8 MGYH Minimal Glycerol Medium + Histidine (最小甘油培养基 + 0.004%组氨酸) 在1000ml的MGY培养基中加入10ml的100*H母液混匀，4℃保存，保存期为2个月。 2.9 RD Regeneration Dextrose Medium (葡萄糖再生培养基) (含有：1mol/L的山梨醇;2%葡萄糖;1.34%YNB;4*10-5%生物素;0.005%氨基酸) 1. 将186g的山梨醇定容至700ml，高压灭菌; 2. 冷却后于45℃水浴; 3. 将100ml的10*D、100ml的10*YNB;2ml的500*B;10ml的100*AA等母液和88ml无菌水混匀，预热至45℃后，与步骤2的山梨醇溶液混合。4℃保存。 2.10 RDH Regeneration Dextrose Medium + Histidine (葡萄糖再生培养基 + 0.004%组氨酸) 在RD培养基配制的第三步中，在加入10ml的100*H母液，同时无菌水的体积减少至78ml即可，其余配制方法与RD相同。4℃保存。 2.11 RD及RDH平板的制备 1. 将186g的山梨醇和15~20g琼脂粉定容至700ml，高压灭菌;冷却后于60℃水浴; 2. 参照RD/RDH液体培养基配制的步骤4，将100ml的10*D、100ml的10*YNB;2ml的500*B;10ml的100*AA等母液、(10ml的100*H母液)和88(78)ml无菌水混匀，预热至45℃后，与步骤1的山梨醇/琼脂液混匀; 3. 迅速制备平板。4℃可保存数月。 2.12 RD及RDH 的TOP 琼脂的制备(常用于酵母菌的包被) 1.将186g的山梨醇和7.5~10g琼脂粉定容至700ml，高压灭菌;冷却后于60℃水浴; 2.参照RD/RDH液体培养基配制的步骤4，将100ml的10*D、100ml的10*YNB;2ml的500*B;10ml的100*AA等母液、(10ml的100*H母液)和88(78)ml无菌水混匀，预热至45℃后，与步骤1的山梨醇/琼脂液混匀; 3.将该TOP琼脂置于45℃水浴冷却、保温，备用。 2.13 MD与MDH Minimal Dextrose Medium +(Histidine) 最小葡萄糖培养基 +( 0.004 %组氨酸) (含有：1.34%YNB;;4*10-5% 生物素;2%葡萄糖) 1. 100ml的10*YNB;2ml的500*B和100ml10*D母液，用800ml的无菌水定容至1000ml即可; 2. 如配制MDH，可在上述的MD中加入10ml的100*H即可; 3. 如配制平板，可无菌水的灭菌前，加入15~20g的琼脂。4℃可保存数月。 2.14 SOC培养基： Trypton l% Yeast Extract 0.5% NaCl 0.05% Glucose (1mol / L) 2% 121℃高压灭菌 20min，冷却后，4℃保存。 母液的配置注： 10*YNB (含有硫酸铵、无氨基酸的13.4%酵母基础氮源培养基) 4℃保存。34g酵母基础氮源培养基(无硫酸铵)+100g硫酸铵，溶于1000ml水中，过滤除菌。 500*B (0.02%生物素 Biotin) 4℃保存 保存期为1年。20mg的生物素溶于100ml水中，过滤除菌。 100*H (0.4%Histidine 组氨酸) 4℃保存 保存期为1年。400mg的L-组氨酸溶于100ml水中，(加热至50℃以促进溶解)，过滤除菌。 10*D (20%Dextrose 葡萄糖) 保存期为1年。200g葡萄糖溶于1000ml水中，灭菌15min或过滤除菌。 10*M (5%Methanol 甲醇) 保存期为2个月。将5ml的甲醇与95ml水混匀，过滤除菌。 10*GY (10%Glycerol 甘油)保存期为1年以上。将100ml甘油和900ml水混匀后，高压灭菌或过滤除菌。 100*AA (0.5% of each Amino Acid，各种氨基酸) 4℃保存 保存期为1年。分别将500mg的L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸溶于100ml水中，过滤除菌。 1M 磷酸钾溶液(potassium phosphate buffer，pH6.0)，将1mol/L的K2HPO4溶液132ml与1mol/L的KH2PO4溶液868ml混匀，其pH为6.0，如需调节pH，则使用磷酸和氢氧化钾调节pH。 培养基母液配制好了，均要在4℃保存，如果出现沉淀、白色絮状物质等，有可能是溶液配制不恰当产生了沉淀（可能是水质问题等）、母液被菌类污染等，一定要重新配置溶液。 |
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