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日志正文 miRNA介导基因沉默的基本机制 Ana Eulalio, Eric Huntzinger and Elisa Izaurralde Cell 132, 9 – 14, January 11, 2008 微RNA是长度为22核苷的RNA，通过与标靶mRNA 3’非翻译区结合，使转录后的基因表达沉默。尽管对微RNA的生物合成和功能已有较多的了解，但在动物细胞中miRNA使基因表达沉默的机制尚无定论。我们在本文讨论miRNA介导的基因沉默的各种模型，并阐述能消弥模型差异的假说。 微RNA（miRNA）在发育、细胞分化、增殖和凋亡等许多生物学过程中起重要作用。最近的证据表明miRNA也与癌症和代谢异常等人类疾病有关。在非脊椎动物中至少鉴定了100个miRNA基因，在脊椎动物和植物中已鉴定了500 – 1000个miRNA基因。根据对miRNA标靶的计算机预测，估计每个miRNA调节几百个不同的mRNA，因此相当大一部分转录体可接受miRNA的调节。 miRNA为了执行调节功能，与Argonaute家族结合形成由miRNA诱导的沉默复合物(miRISC)。在这些复合物中，miRNA指导Argonaute蛋白进入完全或部分互补的mRNA标靶，使这些mRNA保持转录后沉默。 尽管我们对miRNA生物合成和功能的理解正在不断加深，但对miRNA用以调节基因表达的机制仍无定论。已发表的研究表明，miRNA以4种不同的方式抑制蛋白质表达：（1）与翻译偶联的蛋白质降解；（2）翻译延长的抑制；（3）翻译提前终止（核糖体脱落）；（4）翻译起始的抑制。另外，尽管有不完全的mRNA—miRNA碱基配对，动物miRNA能够诱导mRNA标靶大量降解。微RNA还可以在称为mRNA加工体或P体（不存在翻译机制）的独立细胞质位点，通过螯合mRNA使其沉默。我们在本文中讨论这些不同的miRNA抑制机制的证据以及这些机制的差异。 翻译起始后的抑制机制 早期在线虫中的研究以及最近在哺乳动物细胞培养物中的研究提供了miRNA在翻译起始后抑制蛋白质合成的有利证据。尽管这些研究的细节有所不同，但其结论都来自一个共同的观察，即miRNA及其标靶在蔗糖沉降梯度中与多聚核糖体结合在一起。因为这些多聚核糖体对各种抑制翻译的条件敏感，说明它们有翻译mRNA标靶的活性。例如，这些多聚核糖体与多羟基瑙醇、嘌呤霉素或密旋霉素等翻译抑制剂短暂保温后，可分离成核糖体单体或核糖体亚基。 miRNA的标靶明显可被有效翻译，但却检测不到相应的蛋白质产物，人们从这种自相矛盾的观察中提出了新生多肽链可能在翻译的同时被降解的假说。然而，这种假说是建立在负结果，而不是建立在直接的正面证据上。例如，假定的蛋白酶的性质尚不清楚。蛋白酶体参与的可能性已被排除，因为蛋白酶体抑制剂无法恢复沉默的报告mRNA的蛋白质表达。 为了研究miRNA如何使标靶沉默，Petersen等设计了一个含有3’非翻译区(3’ UTR)的合成的miRNA报告mRNA，其3’ UTR带有6个与转染siRNA（miRNA类似物）部分互补的相同位点。当这个报告mRNA瞬时表达时，它与多聚核糖体结合，尽管siRNA抑制它的表达。但是如果翻译起始受到抑制，这些核糖体的解离要比与对照（无抑制）mRNA结合的核糖体的解离更快。由此产生了miRNA引发核糖体提前解离或核糖体脱落的假说。 miRNA介导翻译起始后的抑制还有另外的证据：即使是通过含有一个内部核糖体进入位点(IRES)的5’ UTR启动的报告mRNA的翻译，也会发生沉默。因为IRES启动的mRNA的翻译与与mRNA帽结构无关，所以这些结果表明miRNA是在帽识别之后的阶段抑制翻译。 翻译起始的抑制 与上述研究不同，Pillai等展示了miRNA及其标靶在蔗糖梯度中不与多聚核糖体结合，而是与哺乳动物细胞中的自由mRNP结合，这说明翻译抑制发生在起始阶段。另外，在上述以及在其他研究中，通过不依赖帽的机制（即通过IRES）进行翻译的mRNA很难再被miRNA所抑制，这进一步支持miRNA抑制依赖于帽的翻译起始的论点。 与miRNA在阻断翻译起始中起作用相吻合的是，Kiriakidou等报道了一个出人意料的观察：Argonaute蛋白的中心结构域与细胞质帽结构蛋白eIF4E（真核翻译起始因子4E）有序列相似性，eIF4E是依赖于帽的翻译起始所必需的。eIF4E通过在处于两个色氨酸之间的帽的甲基化碱基上的堆积，与mRNA的m7Gppp-帽结构结合。在与eIF4E的色氨酸相对应的位置上，Argonaute蛋白有可介导类似相互作用的苯丙氨酸。类似的发现还有Kiriakidou展示的人Argonaute2(AGO2)与葡聚糖凝胶珠上的m7GTP的结合，甲基化帽类似物（如m7GpppG）可与这种结合形式竞争，而非甲基化m7GpppG不能形成竞争。这些研究人员进一步展示了用缬氨酸置换一个或两个AGO2苯丙氨酸可消除基因沉默活性。这些结果支持miRNA通过从帽结构中置换eIF4E，在帽识别步骤抑制翻译。 Chendrimada等报道的证据也说明miRNA抑制一个早期翻译步骤（在延长步骤之前）。他们用人细胞展示了AGO2可与eIF6以及核糖体大亚基结合。eIF6通过与核糖体大亚基结合，防止大亚基过早地与核糖体小亚基连接。如果AGO2使eIF6与之结合，核糖体的大亚基和小亚基则可能无法结合，导致翻译受到抑制。 尽管Kiriakidou和Chendrimada都提供了miRNA在翻译延长步骤之前抑制翻译的研究结果，但他们提出了相互排斥的基本机制。我们必须更全面地研究eIF6和Argonaute的帽结合结构域怎样在mRNA沉默中起作用。特别是在没有关于真核Argonaute蛋白结构信息的情况下，对Kiriakidou的研究结果的另一种可能的解释是，苯丙氨酸的突变可通过一种不同的机制影响该蛋白质的活性。而eIF6是核糖体60S亚基生物合成所必需的，它的缺失可能有我们不完全了解的其他影响。 miRNA介导的mRNA降解 最初的研究曾报道动物miRNA抑制翻译，对标靶mRNA的丰度没有多大影响。然而最近的研究报告表明动物miRNA确实导致标靶大量降解。这方面的证据包括，在miRNA途径受到抑制（如去除Dicer或Argonaute蛋白）的细胞中，预期的有功能的miRNA标靶的水平增加。相反，如果特定miRNA异常表达，含有这些miRNA结合位点的转录产物的丰度就会减少。同样，有几个例子说明特定miRNA的表达与含有互补结合位点的转录产物的减少有相关性。例如，在斑马鱼胚胎的配子转录启动时，miR-430表达的大量增加伴随有在3’ UTR含miRNA位点的母系mRNA的大量降解。 在动物细胞中，miRNA不是通过Argonaute蛋白的内切核苷水解切割降解mRNA，而是将mRNA送到普通mRNA降解机制中（除非miRNA与标靶完全互补）。在斑马鱼胚胎、线虫、果蝇和人细胞中对miRNA加速其标靶的脱腺苷化和脱帽的研究支持上述观察。 miRNA介导的信使RNA降解需要Argonaute蛋白、P体组分GW182、CAF1-CCR4-NOT脱腺苷酶复合物、脱帽酶DCP2和几种脱帽活化因子（包括DCP1, EDC3和RCK/p54）。目前的证据表明GW182通过直接作用于Argonaute蛋白而与miRNA标靶聚集，从而在翻译抑制中起作用。GW182也是通过脱腺苷化和脱帽降解的转录产物标靶的标记。 尽管有重要证据显示miRNA启动标靶的降解，但仍有一个悬而未决的重要问题：标靶降解是一个造成沉默的独立机制还是由于影响翻译而造成标靶降解？某些证据表明miRNA介导的mRNA降解不与翻译偶联。在人细胞中，可通过在miRNA标靶的5’ UTR插入一个强力茎环结构抑制标靶的翻译，但这种标靶仍然以依赖于miRNA的方式脱腺苷。同样，在斑马鱼胚胎和人细胞抽提物中，尽管miRNA标靶有可破坏翻译的缺损的帽结构(Appp-帽)，但它们仍可脱腺苷。此外，在果蝇细胞和人细胞抽提物中，在不进行翻译时亦可发生miRNA介导的mRNA降解。 降解的程度明显是由mRNA标靶而不是由miRNA决定，这是因为相同的的miRNA可以标靶专一性方式抑制翻译或诱导mRNA降解。Aleman等发现miRNA是进行降解还是进行翻译抑制取决于miRNA-mRNA二聚体的结构（即误配的数量、类型和位置）。Grimson等发现miRNA结合位点的数量、位点之间的距离以及在3’ UTR中的位置和RNA的环境都强烈影响调节的程度，尽管在每种情况中翻译抑制和降解的相对作用尚不清楚。因此，miRNA是否进行mRNA降解主要取决于miRNA结合位点和RNA环境的特定性质，最可能的决定因素是miRNA与特定标靶结合蛋白的特殊相互作用。 在P体的螯合 Argonaute蛋白、miRNA和miRNA标靶共处于一个称为P体的细胞质位点。P体的其他组分，如GW182、CAF-CCR4-NOT脱腺苷酶复合物、脱帽酶DCP2、脱帽激活因子（如DCP-1、EDC3、Ge-1）和RNA解旋酶RCK/p54等都参与miRNA功能。 Argonaute蛋白、miRNA和miRNA标靶在P体的测定产生了一个miRNA标靶在P体中螯合的模型，即miRNA标靶与翻译隔绝并可能被降解。人们对miRNA定位于P体是mRNA沉默的原因还是结果仍无定论。然而，最近的研究证实，在缺少可探测到的微小P体的细胞中，miRNA途径并不受影响。因此尽管P体组分在miRNA介导的基因沉默中起重要作用，但miRNA的功能并不需要这些组分聚集成为微型P体。这些结果说明基因沉默是在可溶性细胞质部分开始的，但是沉默机制在P体的定位并不是沉默的原因，而是它的结果。 体外研究的结果 miRNA对翻译起始的抑制已在各种来源的无细胞抽提物的体外研究中得到重复，包括兔网织红细胞裂解物、果蝇胚胎抽提物以及两种哺乳动物细胞系（小鼠Krebs-2腹水和人HEK293F细胞）的抽提物。miRNA可在上述抽提物中使有m7Gppp帽的mRNA的翻译沉默，但不能使有合成的Appp帽结构（与polyA尾无关）的转录产物的翻译沉默。在小鼠和人细胞抽提物中，以依赖于IRES方式启动翻译的转录产物很难被miRNA调节。 对poly(A)尾在沉默中的作用研究的很少，在正式研究这个问题时，无多聚腺苷化的mRNA或者在体内沉默，或者在体内和体外都不沉默或部分沉默，与帽结构无关。 Wakiyama等观察到了mRNA沉默确实需要帽结构和poly(A)尾。他们的细胞抽提物还重复了早先在斑马鱼胚胎以及在人和果蝇细胞中观察到的miRNA介导的脱腺苷化。根据这些观察，Wakiyama等提出miRNA启动脱腺苷化。在他们的模型中，翻译受到抑制是由于无法合成帽结构和poly(A)尾。人们已清楚知道如果细胞质poly(A)结合蛋白(PABPCI)与mRNA的poly(A)尾结合，它可以与翻译起始因子4G(eIF4G)相互作用。eIF4G通过与eIF4E的相互作用与帽结构结合。这种相互作用诱导mRNA形成一个闭环，可极大地增加翻译。沉默的mRNA不能形成闭环，因为这些mRNA已被脱腺苷化。 值得注意的是，对脱腺苷化是基因沉默的原因还是结果仍有争议。Wakiyama发现所有含miRNA结合位点的mRNA都以依赖于miRNA的方式脱腺苷化，包括由于在5’ UTR有Appp帽或IRES而不能沉默的mRNA。这项发现与在斑马鱼胚胎中报道的结果一致。脱腺苷化在环己胺存在时仍可发生，说明它不需要和翻译同时进行。这些结果可看作是脱腺苷化引起翻译抑制的证据。 其他研究表明除了脱腺苷化，还有另外一些引起翻译抑制的机制。例如，在果蝇细胞中去除脱腺苷酶复合物中的一个必要组分（NOT1），可阻止miRNA介导的mRNA降解，但并不能使蛋白质表达完全恢复，这说明报告mRNA仍在翻译水平保持沉默。与之类似的是，Wu等表明在人细胞中，poly(A)尾被一个组蛋白茎—环结构置换后的报告mRNA仍受miRNA的抑制，这说明翻译抑制不是由脱腺苷化引起的。 Mathonnet等报道了一个重要发现：加入纯化的起始复合物eIF4F(其中包括细胞质帽结合蛋白eIF4E、支架蛋白eIF4G和RNA解旋酶eIF4A)能阻止mRNA沉默。Kiriakidou等提出过Argonaute蛋白与eIF4E竞争对帽结构的结合，上述观察与他们的观点完全吻合。eIF4E的更换可阻止mRNA环化，因而增加脱腺苷化。总而言之，尽管体外研究有细节上的不同，但都表明miRNA干扰翻译起始的早期阶段。 为什么有如此多的反应机制？ 协调miRNA调节基因表达的各种已有模型是很困难的。也许这些不同的模型反映了不同的解释和不同的实验方法。另一种可能性是miRNA确实需要通过多种机制来抑制基因表达。还有一种可能性是miRNA需要通过一种共同的单一机制使基因表达沉默，已有的各种反应模型是这种基本机制的次级反应。 我们是否在测定基因沉默中的关键因素？ 原则上我们可以通过分析沉默的报告mRNA在蔗糖沉降梯度中的位置，轻易地将miRNA介导的翻译抑制的后起始模型与起始模型加以区分。在第一种模型中，报告mRNA应与多聚核糖体处于蔗糖梯度的相同部分中，而在第二中模型中，报告mRNA应该在蔗糖梯度的自由RNP部分（即在梯度的顶部）。不幸的是，这些实验没有给出确切的结果，因此很难对结果进行解释。 首先，除了EDTA处理外，大多数解离多聚核糖体的条件（如嘌呤霉素、多羟基瑙醇或密旋霉素处理）不能定量地将mRNA从多聚核糖体部分转移到mRNP部分，而是将其从较重的部分转移到较轻的部分。这种转移在某些情况中属于实验的测定误差。第二，miRNA的抑制作用是在2—5倍的范围。因此，20%到50%的报告mRNA不沉默。报告mRNA群体的这种不均一性可能影响实验结果。第三，一部分受到抑制的mRNA可能会部分降解（大多数研究不能排除报告mRNA有10%—15%的降解）。根据调节的程度，这可能代表相当一部分沉默的mRNA。 由于上面提到的困难，很明显沉降图并不能提供支持或否定某一机制的明确证据。出于对上述方法局限性的警惕，许多研究使用一个独立的方法以便得到正确的结论。IRES的使用是这种独立方法之一。在特定研究中，用含有IRES的报告mRNA得到的结果与多聚核糖体沉降图分析结果一致，但在不同的研究中结果很不相同，说明存在实验偏差。 实验方法的偏倚？ 大多数翻译起始受到抑制的证据来自对体外合成后再与无细胞抽提物一起保温的mRNA的研究，或来自对转染进入培养细胞的mRNA的研究。miRNA标靶在体内并不是“裸”mRNA，而是以核糖核蛋白体或mRNP形式存在。一般认为RNA结合蛋白是在转录时或在加工期间与mRNA结合。因此与体内转录的mRNA完全互补的蛋白质可能不同于在体外系统或在mRNA转染后与mRNA结合的蛋白质。这也许可以解释某些研究中观察到的差异，如在Humphreys等人和在Petersen等人的研究中出现的差异。这些研究的意义是RNA结合蛋白对miRNA的终极调节作用有很大的影响。 研究分歧的另一个来源是报告mRNA的性质。某些研究使用的人工报告mRNA在非同源的3’ UTR中含有多个相同的miRNA结合位点。为了达到有效的基因沉默，这些人工报告mRNA需要有多达6个miRNA结合位点，而天然的3’ UTR很少有6个等距离的相同miRNA结合位点。因此人工报告mRNA可能无法完全重现miRNA的调节。另外，在使用这类报告mRNA时，可能会观察到不同的机制，所以仅依据这些报告mRNA无法解释在实验中观察到的所有差异。 其他的实验差异存在于是使用体内转录加工的miRNA还是使用转染的siRNA。如果报告mRNA含有部分互补的miRNA结合位点，一般认为siRNA可进行miRNA的反应。然而，目前尚不清楚在人细胞中，双链miRNA或siRNA中间物的生物合成途径或结构怎样影响miRNA或siRNA与哪一种Argonaute蛋白结合。在果蝇的研究中已证实，是微小的RNA双链结构而非生物合成途径决定哪一种含有Argonaute的复合物与miRNA或siRNA结合。如果在人细胞中也是如此，内源miRNA和转染的siRNA将与不同的Argonaute复合物结合。 一共有4种人Argonaute同源蛋白，它们可能都是通过类似的机制（尽管尚未得到深入研究）抑制翻译。大多数研究没有建立哪一种Argonaute同源蛋白具有基因沉默活性。这引发了下列问题：不同的Argonaute蛋白是通过相同的还是不同的分子机制使互补的标靶沉默？由此产生的推论是不同研究中的差异是否反映了不同的Argonaute蛋白或具有不同蛋白组分的Argonaute复合物的不同反应？含有mRNA—蛋白质复合物的Argonaute的生化纯化揭示了与个别Argonaute蛋白结合的mRNA确实不完全相同，这说明存在一定程度的标靶选择专一性。 多重机制还是多种输出？ 对天然全长3’ UTR进行比较的研究指出，miRNA调节的最终影响取决于标靶3’ UTR的特征和序列。在这些研究中，就每一对miRNA标靶而言，翻译抑制或mRNA降解对基因沉默有不同的影响。 应力条件进一步为3’ UTR周围序列的重要性提供了证据，因为诸如HuR类蛋白与阳离子氨基酸转运蛋白1(CAT-1)mRNA的3’ UTR的结合可解除miR-122介导的基因沉默。尽管还不清楚HuR是直接置换miR-122还是通过反式作用间接影响其功能，但其他的RNA结合蛋白也很可能通过标靶专一性方式阻止、调节或影响miRNA调节的内容和方式。RNA结合蛋白调节miRNA功能的例子正在不断增加。 然而，miRNA仍可能是通过一个共同的单一机制使表达沉默，多种反应模式只是反映了这种基本机制的次级影响，而并非是独立的机制。这些次级影响可以因细胞或标靶的不同而发生变化。例如，翻译抑制可能是一个按照标靶或细胞专一性发挥作用的基本机制，它可以引起也可以不引起mRNA降解。与标靶mRNA结合的蛋白质确实可以影响降解。细胞专一性也可能影响降解。例如，在体细胞中，斑马鱼nanos1 mRNA通过miR-430脱腺苷化和降解，但在生殖细胞中很难进行同样的miR-430的调节。 同样，人们可以想象与翻译同时发生的蛋白质降解是在翻译延长过程中发生的基本机制的作用结果。沉默的核糖体可发出诸如新生肽链受到降解的翻译异常信号。Nottrott等曾经描述过新生肽在翻译同时被降解的例子。 结论 越来越多的证据表明miRNA在人类疾病中，如在癌症、神经疾病、代谢疾病和病毒感染中起重要作用。对miRNA介导的基因调节机制的深入理解，对评估miRNA作为潜在治疗标靶至关重要。尽管我们已开始理解miRNA的生物合成并鉴定了重要的miRNA功能影响因子，但miRNA在动物细胞中的作用模式仍有极大争议。我们认为目前所观察到的不同的机制不太可能是由于不同的技术方法。相反，我们倾向于认为以不同方式出现的miRNA抑制作用取决于mRNA标靶的特征和组分。目前我们无法判断这些不同的抑制模式是代表多个不同的沉默机制还是代表一个单一基本机制的多种作用结果。 |
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