|
今天的这篇综述是2019年9月美国康奈尔大学威尔医学院药理学系Samie R. Jaffrey教授在影响因子高达80分的《Nature Reviews Molecular Cell Biology》杂志上发表的。虽然发表有两年了，但是对于广大的同学来说，仍然是绝对值得认真学习，吸取精华。为了帮助大家更好的吸收综述的内容，本工在阅读综述的时候，也给大家翻译了遍（除了introduction，因为内容和之前的推送重复较多），希望能给大家带来有真正价值的“学术营养”。m6A是mRNA中最丰富的mRNA内部修饰，并已成为一种广泛的调控机制，调控不同生理过程中的基因表达。全转录组的m6A图谱揭示了m6A修饰在细胞RNA中的分布和模式，这也被称为表观转录组（表1）。这些图谱揭示了受m6A调控的特定mRNA，并提供了m6A修饰与细胞分化、肿瘤进展和其他过程之间的机制联系。m6A对mRNA的影响是由m6A readers和m6A writer（修饰酶）复合体成分以及潜在的erasers（去修饰酶）所介导的。在本文中，我们回顾了一些新的和刚发现的表观转录组特征和定量方法，并讨论了关于我们对m6A readers、writer和eraser的机制和功能的理解。发生m6A甲基化的mRNA的“生命周期”在转录期间就开始了。m6A的write（修饰/writing）和擦除（去修饰/erasing）主要发生在细胞核阶段，因为由核心成分N6-腺苷甲基转移酶METTL3及其衔接蛋白（adaptors）组成的m6A writer复合体（图1）（见下文），以及m6A去修饰蛋白都主要定位于细胞核。在核阶段，m6A可以结合特定的核reader，这可能会影响mRNA的剪接或其他核过程。在输出到细胞质后，m6A与特定的细胞质reader蛋白结合，从而影响mRNA的稳定性、翻译和/或定位。1978年所发现的m6A的最显著功能是导致mRNA不稳定。这项研究使用放射性同位素代谢标记来比较含有m6A修饰的mRNA和缺少m6A修饰的mRNA的半衰期。这为m6A的功能作用提供了首个证据。最近的研究表明，细胞质的m6A结合蛋白YTHDF2（也称之为DF2）可促进m6A的不稳定性（图1）。然而，DF2发生耗竭后也只稍微稳定了m6A修饰的mRNA（mRNA半衰期平均增加约30%）。这与METTL3的耗竭可形成鲜明的对比，后者可使得mRNA半衰期更显着地增加。因此，m6A对mRNA稳定性的影响不太可能仅由DF2介导。胞质mRNA不会发生m6A甲基化，因为m6A的形成是在细胞核内与转录共同发生的。因此，与蛋白质磷酸化可以在细胞质中以信号依赖的方式发生有所不同，信号通路不会在细胞质的mRNA上诱导m6A，m6A也不会在信号通路的作用下诱导发生转录组转换。相反，m6A是细胞核事件的一个印记，它标志着转录本在到达细胞质时，其半衰期更短。许多研究通过三种不同的机制将m6A与翻译上调相联系起来。第一种是典型的m6A reader YTHDF1，也被称为DF1，它被认为会与真核翻译启动因子eIF3结合，eIF3是一种多蛋白复合物，可将其小核糖体亚单位招募到mRNA上以促进翻译。由于m6A和DF1的结合点大多位于终止密码子周围和3'UTR中，这个意味着DF1可将eIF3招募到这些区域。鉴于eIF3通常位于AUG起始密码子的上游以促进翻译的启动，所以目前还不清楚eIF3招募到终止密码子却会如何增强翻译的。m6A介导翻译增强的另一个机制涉及5'UTR 处的m6A与eIF3发生直接结合。只有当m6A修饰存在于5'UTR时才会增强翻译，这也大概反映了m6A依赖性的eIF3在起始密码子上游的定位作用。令人惊讶的是，m6A介导的翻译启动不需要eIF4E，含有7-甲基鸟苷的mRNA cap结合蛋白可招募eIF3。因此，m6A的存在绕过了对eIF4E的正常需求，可能这也是eIF4E功能受损时的一种重要翻译模式。因为只有少数mRNA在5'UTR中含有m6A，所以这种机制只限于一小部分含有m6A的mRNA。然而，在压力下，热休克蛋白所编码的mRNA和其他在其5'UTR区域含有m6A的转录本会被诱导，从而可能在压力下增强翻译。另外，m6A似乎也在环状RNA中有所富集，m6A可能通过这一机制增强这些转录本在开放阅读框的翻译。翻译增强的第三个机制涉及METTL3的直接翻译激活。在这个模型中，METTL3在细胞核中可甲基化mRNA，但在输出到细胞质时仍与转录本发生结合。一旦进入细胞质，METTL3与eIF3结合，eIF3再与mRNA cap相关蛋白发生相互作用。这可以使得在mRNA 3'UTR处的METTL3和同一mRNA的5'mRNA cap之间形成mRNA环路。这被认为可使得处于终止密码子处的核糖体能够重新加载到转录本的5'UTR处。但目前仍不清楚METTL3如何在没有METTL14衔接蛋白的情况下与RNA结合，因为核糖体通常会在终止密码子处发生分解；以及这一机制又会如何调节细胞质的mRNA，因为通常METTL3在细胞质中用标准的免疫荧光方法不能检测到。核糖体的分析研究一般不支持m6A在大多数m6A所修饰的mRNA中促进翻译的作用。对照组和METTL3敲除组的细胞核糖体分析数据的比较结果显示，除了在5'UTR中有m6A修饰的一小部分mRNA外，mRNA翻译的变化可以忽略不计。这些数据与DF1或METTL3（两者都可结合整个转录本中m6A）可增强翻译的观点不一致。根据一些细胞类型的多聚核糖体分析，这些研究似乎也支持METTL3在翻译中的作用，但这些影响不大/比较温和（modest）。需要进行更多的研究来确定m6A是否具有增强mRNA翻译的一般作用以及所涉及的确切机制。一些关于m6A在调控剪接中的作用最有力的证据来自于对黑腹果蝇的研究，其中内含子的m6A可影响到性别决定的核心基因Sex lethal的剪接。在哺乳动物中，m6A和mRNA剪接之间的联系还不太清楚（这篇综述是2019年的，其实现在已经有比较多的研究了）。为了确定m6A是否调节哺乳动物的可变剪接，一个主要的方法是确定m6A是否位于外显子或内含子剪接位点附近，在那里m6A可以直接影响剪接。然而，在内含子区域定位m6A是具有挑战性的，因为细胞中内含子RNA的数量非常少。一些研究小组表明，m6A可位于外显子5'剪接位点附近。然而，其他研究人员在进行高分辨率的m6A研究时发现，在外显子5'剪接位点附近并没有m6A的富集，在内含子中缺乏m6A。然而，其他研究人员则在外显子和内含子区域的剪接点附近都发现了m6A。在所有案例中，检查新生 RNA 并可发现不同的m6A模式。准确的分析和映射（mapping）方法或用于制备新生（nascent）RNA的方法可能会解释这些差异。不管在剪接点附近是否发现了m6A，大多数研究都表明METTL3依赖性的剪接事件数量很少。在胚胎干（ES）细胞中，与METTL3基因被敲除的ES细胞相比，只有一小部分已知的可变剪接外显子的剪接发生了改变。这项观察是在两项独立的研究中进行的，它们使用不同的算法来检测可变剪接。在一项研究中，在METTL3基因敲除的ES细胞中，241964个外显子中只有360个是发生了可变剪接的。在另一项研究中，约24万个外显子中的1269个外显子在METTL3基因敲除的ES细胞中出现了可变剪接。这些外显子中只有34个含有m6A。在另一项研究中，在METTL3基因敲除的ES细胞中只观察到了360个存在差异的可变剪接事件，其中只有不到三分之一含有m6A位点。总之，这些研究表明，m6A在直接调控mRNA剪接方面的作用有限。然而，即使m6A可能只影响了少数基因的剪接，但这些依赖m6A的剪接事件可能在功能上仍然是重要的。如果m6A确实影响剪接，YTHDC1（也被称为DC1）可能参与了其中，因为它与剪接调节因子包括SAM68、SC35、SRSF1和SRSF3（见下文reader部分）之间存在相互作用，从而表明DC1与剪接之间存在联系。另一个复杂的问题是，m6A耗竭后所观察到的剪接改变可能是一种间接影响。例如，一些被注释最多的m6A位点的转录本是些常见的剪接调节因子，如SON44、HNRNPC38和HNRNPF45。因此，m6A的耗竭可能会影响剪接调节蛋白的表达，从而难以区分m6A对mRNA剪接的直接影响和由剪接调节蛋白水平改变介导的间接影响。m6A修饰的mRNA被定向调控的一个主要机制是通过液-液相分离的过程。通过研究含YTH结构域家族（DF）蛋白的氨基酸序列，发现了一些m6A和液-液相分离之间的联系，这些蛋白都含有一个大的富含谷氨酰胺/脯氨酸/甘氨酸的约30kDa的低复杂度结构域。一些低复杂性结构域之间具有相互作用的能力，并能在细胞质内“相分离”成凝胶、聚合物或液滴。DF蛋白被证明在与含有多个m6A的RNAs结合（incubated）时可相分离成液滴。这些RNA可招募和并置（juxtapose）DF蛋白，使它们发生相分离，形成RNA-蛋白液滴。这些富含m6A的mRNA液滴随后被分割成内源性相分离的液滴，如应激颗粒、P-小体或神经元RNA颗粒（图2）。因此，m6A可使mRNA更有可能分到这些无膜的小室中，在这些小室中，mRNA可能会被储存、降解或被用于将mRNA运送到神经元的树突（arbors）中。值得注意的是，当多个m6A残基以簇状（clusters）存在时，m6A对mRNA降解的影响最为突出。m6A簇能产生突出效应的原因可能是这些簇在诱导DF蛋发生相分离方面特别有效，从而使mRNA能更有效地被靶向到参与mRNA降解的相分离小室。m6A可能通过结合DC1来加强mRNA从细胞核的输出。DC1和SRSF3之间的相互作用可能会促进mRNA的输出，因为SRSF3是NXF1依赖性的mRNA输出途径中的一个关键衔接蛋白。一致的是，缺乏RNA去甲基化酶ALKBH5的细胞会表现出m6A的增加，也表现出mRNA的输出加速。然而，许多mRNA缺乏m6A，但仍然会从细胞核中输出，因此还不清楚为什么m6A仍被用于输出。此外，几乎没有证据表明转录组中的mRNA输出率有整体性的变化。然而，这些研究也指出了m6A在影响mRNA输出途径方面发挥作用的可能性。m6A是由一个多亚单位的writer复合体以高度特异性的方式添加到mRNA上的，其中只有某些mRNA含有m6A，而在这些mRNA中，只有一小部分潜在的m6A位点会被甲基化。这种转录本特异性和位点特异性的基础仍不甚明了。尽管最近的研究主要集中在mRNA中的m6A，但细胞的总RNA中绝大部分的m6A实际上位于更丰富的核糖体RNA中。哺乳动物的基因组共编码了四种甲基转移酶，以在不同的RNA中产生m6A修饰。mRNA和其他RNA聚合酶II来源的转录本中的m6A主要由METTL3-METTL14异构体产生，其中METTL3是酶的组成部分，METTL14是一种异构激活体，也与靶RNA结合。28S核糖体RNA（rRNA）中的单个m6A则由rRNA N6-腺苷甲基转移酶ZCCHC4所形成，而18S亚单位rRNA中的单个m6A由METTL5-TRMT112复合物所形成，其中METTL5是催化亚单位，TRMT是一种异生衔接蛋白（allosteric adaptor）。最后，U6小核糖核酸（snRNA）中的单个m6A（一种参与剪接的snRNA），是由METTL16所催化的。METTL16还可催化在MAT2A mRNA的U6样序列中形成m6A，MAT2A可编码负责S-腺苷蛋氨酸（SAM）生物合成的酶。此外，METTL16还可催化少量其他mRNA和非编码RNA中m6A的形成。METTL3-METTL14异二聚体复合物修饰mRNA中绝大部分的m6A位点。在小鼠ES细胞中，METTL3的基因组缺失或CRISPR介导的METTL14失活，可导致poly(A)RNA中99%以上的m6A总量丢失。因此，poly(A)RNA中很少有m6A是由METTL16或其他潜在甲基转移酶催化的。基于这个原因，METTL3或METTL14的缺失已被用来研究许多m6A依赖性的功能。在本文中，我们重点研究METTL3-METTL14复合物是如何被调控的，以及它如何决定m6A在转录组中的分布。METTL3作为mRNA中的m6A形成酶的这一发现，揭示了m6A与细胞生理学之间的联系。最初的纯化研究显示，甲基转移酶的活性是由一个>1 MDa的甲基转移酶复合物介导的，该复合物在色谱（chromatography）过程中会迅速解离并失活。然而，将由一个约200 kDa的复合物和一个约875 kDa的复合物组成的两个部分混合在一起，可以重建甲基转移酶的活性。现在已知较小的复合物，即甲基转移酶A（MT-A），包含METTL3和METTL14，而另一个较大的复合物，即甲基转移酶B（MT-B），可能包含额外的衔接蛋白，促进对METTL3与RNA的招募。通过将3H-SAM交联到MT-A复合物中一个约70kDa的蛋白上，确定了百万级道尔顿复合物中的甲基转移酶蛋白。所克隆的酶，最初被称为MT-A70（MT-A亚单位，70kDa），现在被称为METTL3，在酵母、癌细胞和植物发育中实现抗体开发和METTL3缺失相关的研究，而促进了m6A定位方法的发展。尽管对writer复合物是如何被调控的知之甚少，但其快速解离可能与生理有关；体内MT-A和MT-B样成分的调控组装可能会控制其活性。最近的研究表明，一些m6A位点是由甲基转移酶METTL14形成的。METTL14被纯化后，并被证明具有METTL3非依赖性的体外m6A合成能力。这项研究提出，METTL3和METTL14可组装成一个复合物，每个蛋白都能甲基化不同的靶点。另一项研究得出了不同的结论，认为是METTL14可稳定METTL3，并且这些蛋白共同形成m6A。试图解决这种差异的第一项研究使用了各种基因组中假定的腺苷甲基转移酶进行生物信息学分析。这项研究表明，METTL14序列中有一个中断的SAM结合motif，这表明它没有催化活性。因此，作者提出METTL14是METTL3-METTL14复合物中一个无活性的伴侣。此后不久，有三个研究小组描绘了METTL3-METTL14复合物的晶体结构，证明METTL14确实是无活性的，因为它缺乏SAM结合位点，从而证明了这个假设。总的来说，晶体结构表明METTL3和METTL14会形成单个甲基转移酶，其中METTL14可能包含RNA结合位点，是METTL3酶活性的异构活化剂。那么，为什么早期的研究结果报告说METTL14具有显著的甲基转移酶活性？随后的工作表明，在昆虫细胞中表达和纯化的人类METTL14与METTL3的昆虫同源物可形成异二聚体，表明早期研究中归因于METTL14的酶活性实际来自于共同纯化且污染了的昆虫METTL3。这些研究共同推翻了METTL14是负责mRNA中m6A形成的第二个独立甲基转移酶的观点。尽管有这些证据，说METTL14是第二种甲基转移酶的观点在文献中仍然很普遍，部分原因是由于在CRISPR介导METTL3失活后，m6A水平仍然存在。这与其他研究中METTL3的基因组缺失会导致m6A完全丧失形成鲜明对比。在一些研究中所看到的残留m6A可能是由于CRISPR介导的METTL3或METTL14发生不完全缺失，导致形成酶亚型（hypomorphs）。事实上，CRISPR诱导突变引起外显子跳跃也已被证明。当使用CRISPR技术时，METTL3和METTL14似乎非常容易形成亚形，因此验证METTL3或METTL14蛋白已被删除，以及残留的截短蛋白缺乏酶活性就变得至关重要。由于m6A的motif DRACH（D=A、G或U；R=G或A；H=A、C或U）在mRNA中每隔约57个核苷酸就出现一次，因此每个转录本都被预测为有许多潜在的甲基化位点。然而，其实这些DRACH序列中很少有被甲基化的。此外，尽管DRACH序列广泛存在，但只有特定的转录本才会有m6A修饰。关于这种位点特异性和转录本特异性甲基化的基础/原因还不甚明了。选择转录本进行甲基化的一个机制可能是通过转录因子将writer复合物募集到特定的启动子（图3）。例如，在人类胚胎干细胞中，SMAD2/3转录因子与METTL3、METTL14和METTL3衔接蛋白WTAP结合，从而促进SMAD2/3诱导的转录本在TGFβ信号作用下的甲基化。约有150个基因被证明是通过这一机制调节的。在急性髓性白血病（AML）细胞中，CAATT-box结合蛋白CEBPZ与约70个不同的基因启动子结合并招募METTL3，以上调这些基因所产生的转录本的甲基化。重要的是，这些机制似乎只介导了细胞中含有m6A的转录本总数中的很小一部分，表明还有其他目前未知的机制来解释转录本组中大部分的m6A。其他启动子的特征，如CpG岛的数量和启动子的结构，也已被发现与mRNA中的m6A水平相关，并可能招募可解释甲基化特异性的因素。转录本的特异性和m6A的位置也可能取决于组蛋白的修饰。Mapping研究表明，m6A优先存在于那些长的内部外显子（internal exons）。外显子有其独特的特征，如核糖体密度大大高于内含子，高水平的某些组蛋白修饰，如组蛋白H3赖氨酸36的三甲基化（H3K36me3）和H4K20me1。因此，染色质标记可能会指导mRNA甲基化。最近的研究报道，H3K36me3与mRNA中的m6A形成有关。有人提出METTL14和H3K36me3之间的相互作用是为了引导writer复合物运到新生RNA和转录本的特定区域（图3）。将负责H3K36me3形成的甲基转移酶Setd2敲除，可导致mRNA中m6A水平下降约40%，从而将这一途径与相当一部分的甲基化事件联系起来。然而，需要H3K36me3才能进行甲基化的特定转录本或特定位点尚不完全清楚。
除了长的内部外显子，m6A也在终止密码子附近有被发现。终止密码子本身不太可能指导甲基化，因为甲基化发生在细胞核中，而终止密码子是在细胞质中被核糖体识别到。相反，mRNA中的末端外显子-外显子连接（通常在终止密码子附近）可能是导致终止密码子附近有m6A富集的关键结构特征。这个区域的m6A富集出现在新生的、与染色质结合的mRNA中，进一步表明这种终止密码子附近的m6A富集是由mRNA生命周期早期的m6A修饰事件所决定的，而不是在这些区域之外含有m6A的mRNA发生选择性胞质降解的结果。由于甲基化是共转录时发生的，转录期间的事件可能决定了哪些DRACH位点被甲基化。m6A writer复合体对H3K36me3标记的定位可以赋予新生转录本位点特异性。另外，METTL3也已被检测到可与RNA聚合酶II结合，这表明m6A writer复合体可以被RNA聚合酶II招募到以诱导甲基化（图3）。通过使用化学抑制剂或RNA聚合酶II突变体，以减缓RNA聚合酶II的速度后，也增加了METTL3的招募和m6A在mRNA中的水平。然而，应该注意的是，目前还不清楚RNA聚合酶II是否通常在终止密码子区域附近或在长的内部外显子中变慢，这也可以解释m6A在这些部位富集的原因。最后，writer复合体的RNA结合成分可能使writer复合体靶向mRNA并促进相邻位点发生甲基化（图3）。甲基化复合体的成分RBM15/15B含有RNA结合域，而RBM15/15B的结合位点在mRNA的m6A位点附近。目前还不清楚有多少m6A位点是writer复合物被RBM15/15B招募到特定转录本区域后所修饰的结果。尽管人们认为m6A的形成主要是在核内，但在某些情况下，m6A修饰也可能发生在细胞质内。例如，尽管RNA病毒的基因组是在细胞质中转录的，但仍可以在其基因组中获得m6A修饰。这些转录本获得m6A的能力表明，有一些METTL3存在于细胞质中。也有其他研究在细胞质中检测到了METTL3。目前还不清楚在细胞质中所组装的含有METTL3的writer复合物是否与经典核writer复合物相似。m6A影响mRNA命运的一个主要机制是通过招募m6A结合蛋白。含YTH结构域的蛋白是第一个被发现的m6A结合蛋白，并为理解m6A在mRNA中的作用提供了机制基础（表2）。m6A还可以通过破坏mRNA结构的稳定性来影响mRNA，从而影响不同RNA结合蛋白的结合。在本文中，我们总结了关于m6A readers的主要发现，并就如何鉴定真正的m6A结合蛋白提供了一些见解。含有YTH结构域的蛋白质与m6A结合的发现来自于体外m6A-RNA pull-down实验，该实验发现了YTHDF2和YTHDF3。根据YTH结构域与其他RNA结合结构域的同源性，之前有人认为它是一个与RNA结合的结构域。随后的研究正式证明，约含150个氨基酸的YTH结构域以m6A依赖性的方式结合RNA。哺乳动物基因组中有五个含YTH结构域的蛋白，它们分为三类。YTHDC1（也叫DC1）、YTHDC2（也叫DC2）和YTHDF（叫DF）蛋白家族。DC1主要是核型，DF蛋白是胞质型，DC2既可以是核型又可以是胞质型。结构研究表明，含YTH结构域的蛋白质与m6A甲基部分结合的选择性主要是通过一个“色氨酸笼（tryptophan cage）”实现的，其中有两个或三个色氨酸包裹着甲基。DC1与mRNA剪接、非编码RNA XIST69介导的表观遗传沉默和mRNA的核输出有关。DC1被发现定位在细胞核中动态的和细胞周期调节的点状结构中，DC1的原始名称叫YT521-B86，这些结构被称为“YT小体”。根据DC1和SRSF蛋白的共同定位，以及对核小体的蛋白质组学研究，YT小体现在被认为是核斑点（nuclear speckles）。值得注意的是，和DF蛋白一样，DC1包含有一个大的低复杂度结构域。因此，相分离可能对DC1的功能至关重要。由于核斑点与活跃的转录位点有关，DC1可能在mRNA转录和甲基化后不久就与它们结合。结合后，DC1可能影响剪接。DC1与SRSF3结合，这被认为是使DC1通过置换SRSF10来促进外显子包含。这些影响与m6A通过招募特定的剪接因子在塑造RNA剪接动力学方面的潜在作用相一致。然而，目前还不清楚剪接调节是否是m6A的一个主要功能，以及m6A介导的剪接调节是否由DC1或其他m6A依赖性机制所介导（见上文关于mRNA剪接的部分）。DC1似乎也能介导非编码RNA中m6A的功能。使用紫外交联免疫沉淀（CLIP）方法对YTH蛋白进行的全转录组结合的研究表明，DC1优先结合非编码RNA中的m6A位点，如XIST、NEAT1和MALAT1，而DF家族成员优先结合mRNA的m6A位点。尽管m6A存在于不同的非编码RNA中，如NEAT1和MALAT1，但仅在XIST中对其功能进行了研究（现在有不少了）。XIST是一种非编码RNA，有助于X染色体的失活和X染色体上基因的沉默。m6A的耗竭可通过招募DC1增强XIST介导的沉默，这可能会促进其他表观遗传沉默蛋白的招募。而DC1是否有助于其他非编码RNA的功能则尚不清楚。YTHDF家族包括三个高度相似的旁系同源物。YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3（也分别称为DF1、DF2和DF3）。DF蛋白在其整个长度上具有非常高的氨基酸一致性。除了DF1-DF3中几乎相同的YTH结构域外，序列的其余部分（约400个氨基酸）是一个低复杂度的区域，缺乏可识别的模块化蛋白结构域，包含几个类似于朊病毒的P/Q/N结构域。如上所述，这些结构域可使DF蛋白发生相分离，通常与结合的m6A mRNA一起发生。这种相分离特性以m6A mRNA为靶标，并由 P小体、应激颗粒和其他RNA-蛋白组件处理。虽然这三种DF蛋白都有同样的能力来加强m6A mRNA的相分离，但关于它们是否各自对m6A mRNA有专门的影响，却有着矛盾的证据。早期的研究报告指出，三种DF蛋白对m6A mRNA的作用各不相同。DF1可增强m6A修饰的mRNA发生翻译，DF2促进其降解，而DF3兼具有这两种功能。然而，其他使用报告RNA降解或mRNA去乙酰化是的实验表明，DF1/2/3在mRNA降解中都有类似的作用。另外，所有三个DF蛋白似乎都能在m6A mRNA 上募集到主要的细胞mRNA去腺苷酸化复合物，称为CCR4-NOT。DF2以前被证明在经历了热休克诱导后可重定位到细胞核，以调节压力诱导的m6A writing途径；然而，随后的研究发现了没有压力诱导所发生的DF2核重定位，这表明DF2在调节m6A writing途径方面没有选择性的作用。此外，DF2可能会促进其结合的mRNA发生核酸内切。鉴于DF蛋白之间序列的高度相似性，目前还不清楚DF如何介导不同的功能；需要更多的研究来解决在胞质mRNA上DF功能的这些差异。另一个问题是DF蛋白是否与mRNA中不同或相同的m6A位点结合。一些基于CLIP的研究表明，大多数m6A只与三个DF分子中的一个发生结合，而另一些研究表明，所有m6A位点与所有DF分子的结合方式基本相同。解决这一差异并确定DF蛋白是否结合相同或不同的m6A位点对于深刻理解m6A的机制非常重要。1.4 DC2是一种主要在睾丸中起作用的m6A reader与其他广泛表达的YTH蛋白不同，DC2富集在睾丸中。YTHDC2基因敲除的小鼠会表现出精子发生的缺陷，但没有其他明显的发育缺陷。DC2缺陷型生殖细胞可进入减数分裂，但会在没有经历正常减数分裂基因表达程序的情况下发生过早和异常的中期而凋亡。DC2的结合特性有些与众不同（unusual）。与其他四个含YTH结构域的蛋白不同（与m6A的RNA结合的亲和力从200 nM到1 µM不等），DC2的YTH结构域与m6A RNA的结合力更弱（~5 µM）。YTHDC2结构域保留了色氨酸笼，因此似乎可以结合甲基化的腺嘌呤。然而，DC2的YTH结构域在预测会结合m6A相邻残基的区域表现出了序列的分歧。基于CLIP对转录组中DC2结合位点的研究表明与m6A位点的重叠度很低，而这与其他YTH结构域蛋白有所不同。因此，DC2的YTH结构域可能会结合特殊m6A位点或使用不同的结合模式来影响m6A mRNA。DC2有一个RNA解旋酶结构域，与调节翻译的RNA解旋酶（如DHX29）有相似之处，表明它可能会促进mRNA的翻译。这一假设得到了研究结果的支持，当DC2被人为地拴在reporter RNA上时，翻译会上调。而其他研究表明，DC2可通过招募5'-3'外切核酸酶Xrn1来介导mRNA的降解。在小鼠睾丸中，DC2的耗竭可稍微上调m6A含量高那些mRNA的表达。总的来说，所报道的作用非常小，这也表明DC2的功能还没有被完全的阐明。此外，m6A也可能间接地招募RNA结合蛋白。尽管m6A可以与U形成碱基对，但m6A-U碱基对比A-U碱基对要弱，在短RNA螺旋中存在m6A会破坏它的稳定性，使熔化（melting）温度降低5℃或更多。因此，m6A会降低RNA形成结构的能力，有利于RNA形成线性、未折叠的形式。这种结构的减少使得那些结合单链motif的RNA结合蛋白有更多机会接触到RNA。这一观点首先在HNRNPC中得到了证实，这是一种丰度较高的核型RNA结合蛋白，负责包括剪接在内的pre-mRNA加工。m6A的存在为HNRNPC提供了更多机会接近m6A位点附近的几个结合点。m6A倾向于发生在转录组的非结构化区域，这一现象已得到来自全转录组RNA结构检测的支持。这种m6A诱导RNA去折叠/展开（unfolding）的概念被称为“m6A结构开关”。重要的是，m6A诱导的结构转换可促进基本上任何靠近m6A位点或与之重叠结合位点的RNA结合蛋白发生结合。事实上，结合实验表明，其他在一些m6A位点附近结合的RNA结合蛋白，当没有m6A时，其结合效率会降低。这些蛋白包括HNRNPG（一种参与剪接的RNA结合蛋白），以及A2B1（HNRNPA2B1，一种参与初级microRNA加工的RNA结合蛋白）。任何在m6A残基附近结合的蛋白质在有m6A存在时都会改变结合效率。很难确定一种RNA结合蛋白是直接与m6A结合，还是由于m6A诱导RNA去折叠以及附近结合位点的可及性增加而与有m6A的RNA发生结合。例如，尽管早期的凝胶迁移试验表明，HNRNPA2B1可结合m6A，但最近的研究表明，是m6A诱导RNA展开，使被标记的RNA更容易被HNRNPA2B1接触到。因此，比较非甲基化和甲基化的RNA很复杂，因为这些RNA会因甲基化状态和结构的不同而存在差异。因此，在研究m6A是否可直接结合RNA结合蛋白时，使用不能够形成结构的RNA至关重要。此外，m6A也可以排斥某些RNA结合蛋白。这些蛋白被称为“anti-readers”，如果m6A出现在它们的结合位点上，并且甲基干扰了结合，它们就会被m6A取代。对结合同一RNA甲基化和非甲基化版本的蛋白分析表明，G3BP1（一种参与应激颗粒形成的RNA结合蛋白）会被m6A所排斥。基于结构和结合分析的研究发现，LIN28A（参与microRNA加工的核心多能调节因子），和EWSR1（主要的转录抑制因子），也被发现是anti-m6A readers。目前仍不清楚m6A介导的anti-reader是否介导了m6A相关的生物学功能。核糖体也可能作为m6A readers发挥作用。单分子核糖体转位实验的研究表明，细菌核糖体会在含有m6A密码子的mRNA上滞留。尽管细菌核糖体与哺乳动物核糖体不同，但核糖体分析的数据表明，哺乳动物核糖体也有在m6A位点停滞的倾向。这种机制对m6A mRNA稳定性和/或翻译的影响程度仍不清楚。使用m6A RNA探针和质谱从pull-down实验中鉴定出了其他的m6A结合蛋白。这些蛋白包括FMRP，以及IGF2BP蛋白（IGF2BP1，IGF2BP2和IGF2BP3）。这些RNA结合蛋白中的每一个似乎都能增强m6A mRNA的稳定性。然而，目前仍不清楚这些蛋白是否直接与m6A结合。CLIP研究则同时提供了支持和反对这些蛋白是真正m6A结合蛋白的证据。对一些CLIP研究中鉴定的peak进行motif分析，发现FMRP和IGF2BP蛋白结合的序列motif类似于m6A的DRACH位点；然而，其他的CLIP研究表明，IGF2BP蛋白结合的是不同的共有序列。这些蛋白似乎不是真正的readers的另一个原因是，如CLIP reads分布所显示的那样，它们在全转录组范围内的结合模式与富集在终止密码子的m6A分布不一致。此外，与YTH结构域相反，FMRP和IGF2BP蛋白对有m6A修饰的RNA的结合亲和力较弱，区分甲基化RNA和非甲基化RNA的能力较差。因此，这些蛋白没有显示出直接型m6A readers的那种m6A结合类型。最近的研究为最初观察到的关于FMRP和IGF2BPs可直接结合m6A提供了其他解释。FMRP被发现可直接结合DF2，这与在DF蛋白的“相互作用组学（interactome）”中发现了FMRP的其他研究一致。因此，FMRP可能通过与DF蛋白的相互作用间接地与m6A RNA产生联系。同样，IGF2BP蛋白在pull-down研究中发现可与DF蛋白相互作用，因此可能间接地与m6A RNA相互作用。另一项研究表明，IGF2BPs可由于m6A导致的结构转换而与有m6A修饰的mRNA发生结合。因此，IGF2BPs可能会结合那些因m6A而未折叠的RNA。尽管如此，FMRP和IGF2BPs还是可能在m6A信号中具有重要的作用，但研究它们是作为DF蛋白的结合伴侣还是作为m6A的直接readers将具有重要意义。m6A“erasers”是将m6A转化为A的去甲基化酶，也塑造了m6A表观转录组。尽管对m6A的早期研究表明，m6A erasers对m6A的功能至关重要，它可以动态、快速、信号依赖性的方式催化m6A的去修饰，但现在看来，m6A erasers在正常生理条件下的作用有限。事实上，生化追踪和代谢标记的研究表明，在HeLa细胞的生命周期中，mRNA中的m6A水平是稳定的。相反，m6A的擦除（去修饰）似乎仅限于特定的组织，如睾丸，或在特定压力和疾病相关的条件下。对FTO序列的分析显示，它与双加氧酶的ALKB家族是“远亲”（distant homology），ALKB家族可对被外源性试剂烷基化的DNA和RNA核苷酸去甲基化。基于这些，FTO被发现对甲基化的DNA核苷酸具有脱甲基酶活性，结果表明FTO对这些底物的活性很弱。然而，随后的一项研究提出，FTO是RNA中3-甲基尿苷（m3U）的脱甲基酶，因为与甲基化的脱氧核苷酸相比，它对这种核糖核苷酸的活性更高。随后的研究显示，FTO对mRNA中的m6A具有更高的去甲基化酶活性，从而发现m6A才是FTO的真正底物。然而，一些研究表明，m6A可能不是FTO的生理性相关靶标。例如，对小鼠FTO敲除的大脑转录组进行m6A mapping研究并未发现m6A修饰位点有明显增加，而且从敲除了FTO基因的小鼠胚胎和细胞中所得到的mRNA中，其m6A水平也没有增加。最近使用Mazter-Seq绘制的全转录组m6A化学计量（stoichiometry）结果也表明，全转录组的m6A 化学计量不受FTO的耗竭所影响。体外酶促分析的结果表明，与相关的酶相比，FTO会以异常低的反应速率对m6A进行去甲基化。最后，FTO也没有以m6A序列特异性的方式对RNA进行去甲基化，而这是非特异性酶活性的标志。总之，这些结果表明了m6A的非特异性反应。探索FTO功能的重大进展是发现FTO对m6Am去甲基化的催化活性大大高于m6A。这一发现是基于对野生型和FTO基因敲除型小鼠miCLIP的m6A 峰值强度进行详细重新分析后的结果，发现当m6A位于5'UTR时，FTO缺陷型细胞中m6A水平有轻微的增加。重要的是，5'UTR中的峰值通常反映的是m6Am，因为m6Am仅与mRNA中的m7G帽相邻。当在生化试验中直接进行测试时，m6Am的去甲基化的比率会比m6A高100倍。这种活性对序列背景高度敏感，因为去甲基化需要m7G，这也表明FTO的生理底物是m6Am。虽然FTO可以使mRNA中的m6Am去甲基化，但FTO基因敲除的细胞中，poly(A) mRNA中m6Am在细胞水平中会有微妙的增加。这促使我们用细胞的总RNA的miCLIP来分析FTO敲除型细胞中的其他RNA。m6Am化学计量的定量测量结果表明，在FTO缺失的细胞中，特定snRNA转录本中第一个转录核苷酸位置的m6Am水平增加了约1500%。在野生型细胞中，大多数细胞类型中只有<5%的snRNA具有m6Am。然而，FTO基因敲除的细胞增加了>50%的m6Am化学计量，表明FTO通常可使m6Am去甲基化，从而使大多数的成熟snRNA在第一个编码的核苷酸处含有Am。值得注意的是，FTO敲除的细胞会表现出剪接缺陷。因为snRNAs会介导剪接，所以snRNAs中的m6Am形式也有可能在剪接中发挥作用。总的来说，snRNAs中m6Am甲基化状态的显著改变证实了snRNAs是FTO的靶标，并表明FTO的功能是调控snRNA而不是mRNA的甲基化。FTO调节甲基化修饰而影响snRNAs的确切机制尚不清楚。尽管FTO对细胞中的m6Am有着显著地影响，但有人提出FTO可以作用于m6A，尽管它对这种修饰的反应率很低。在特定的白血病亚型中耗尽FTO会导致m6A水平增加约20%。有人提出，FTO在这些细胞中具有异常的细胞质定位，从而使m6A去甲基化。然而，没有特定的mRNA可使用SCARLET方法直接检测其m6A水平，以确定它是否确实受到FTO的调节。重要的是要确定一个m6A位点，该位点在m6A化学计量方面显示出清晰而显著的变化，以便明确地确定FTO是mRNA的m6A去甲基酶。第二个被发现的RNA去甲基化酶是ALKBH5，它是在m6A去甲基化酶的筛选实验中发现的。ALKBH5是一种内源性m6A去甲基化酶，因为ALKBH5的敲除和过量表达分别可导致细胞中m6A的增加和减少。与FTO不同，ALKBH5对m6Am没有活性。由于ALKBH5是核型的，而且似乎定位于核斑点，所以ALKBH5很可能在核RNA中或在mRNA的核内生物生成期间对m6A进行去甲基化。ALKBH5似乎在小鼠的发育或生理方面没有作用，因为除了精子生成方面的缺陷外，ALKBH5基因敲除型小鼠看起来很正常。值得注意的是，ALKBH5在睾丸和女性生殖组织中富集，这表明它介导了对生殖细胞发育至关重要的m6A去甲基化事件。与正常细胞相反，在某些癌细胞中ALKBH5似乎会被上调，如胶质母细胞瘤干细胞中。ALKBH5在缺氧情况下也可能被上调，其依据是利用染色质免疫沉淀（ChIP）分析发现，缺氧感应转录因子HIF-1α会与ALKBH5的启动子结合。与此一致的是，ALKBH5可被乳腺癌干细胞所暴露的缺氧环境所诱导。也有研究发现病毒感染后会诱导ALKBH5。因此，ALKBH5可能会在不同的疾病背景下发生上调，以调节表观转录组。特定的转录本和m6A位点可以介导ALKBH5表达增加的致癌作用。例如，NANOG的mRNA（一个重要的多能性基因），在ALKBH5水平升高的乳腺癌细胞中会表现出m6A水平下降。另一个潜在被ALKBH5所调节的mRNA是FOXM1（一种调控细胞增殖的转录因子）。FOXM1可与反义RNA形成双链，使其m6A被ALKBH5去甲基化，这表明ALKBH5的特异性可能需要独特的RNA结构。总的来说，已有的这些数据表明，ALKBH5介导的m6A去甲基化对精子发育至关重要，并可能在ALKBH5发生上调的某些疾病背景中发挥作用。总之，FTO和ALKBH5分别可使m6Am和m6A去甲基化，它们的靶标RNA可能不是mRNA，而是snRNA，至少FTO的情况是如此。未来的研究应该去探索这些酶的主要靶标和调节这些酶以诱导RNA去甲基化的机制。关于m6A是如何添加到mRNA上或从mRNA上擦除，以及m6A是如何调节基因表达的，这些问题尚未得到完全的解答。此外，尽管绘制m6A图谱是一个关键的进步，但它并没有提供关于化学计量的信息。较新的方法，如Mazter-Seq，将能够精确地确定m6A在特定mRNA特定部位上的化学计量，这也就可以确定表观转录组在不同细胞和疾病条件下是否确实是动态和可变的。使用Mazter-Seq和开发新的方法来实现m6A的化学计量，对于揭示是“受调控的”m6A位点而不是“组成型”的m6A位点来说至关重要。最终，这些研究将揭示表观转录组可以在多大程度上受到动态调控以影响基因表达。了解不同的m6A writer的成分及其调控可能是研究那些受到调控的m6A位点性质和功能的关键。除了了解m6A的writing，确定DF蛋白是否能被激活以诱导含有m6A的mRNA发生降解、翻译和/或定位也很重要。了解众多新发现的m6A readers是否确实可识别m6A或者它们是否是DF蛋白的结合因子和潜在的调节因子也很重要。此外，DF蛋白是否介导了m6A的大部分作用或者其他途径，这其中是否是通过m6A的结构转换机制，是否又有助于m6A在生理过程中的作用，这些都有待于阐明。最后，精确地确定哪些腺苷残基受到m6A eraser的控制也是很重要的。新的数据表明FTO可对snRNA中的m6Am进行显著的调节，而不是对mRNA中的m6A或m6Am进行调节。定量测量mRNA中特定位点的m6A水平将帮助人们深入了解哪些位点受到FTO或ALKBH5的调控。
|
