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RNA修饰是一种转录后水平的调控方式，目前已鉴定到超过150种RNA修饰，它们广泛分布于信使 RNA (mRNA)、 转运RNA(tRNA)、核糖体RNA (rRNA)、非编码小 RNA (sncRNA)和长链非编码 RNA (lncRNA)等各类 RNA 上。 6-甲基腺嘌呤(即 m6A)是mRNA上最为常见的一类RNA修饰，早在19世纪70年代就已鉴定到了 RNA上的m6A存在，但其具体的分子功能却一直处于未知阶段。2011年，随着 RNA m6A第一个去甲基酶FTO的鉴定及抗体富集和高通量测序技术的发展，转录组水平m6A分布图谱的精确绘制得以实现，超过25%的转录本上被鉴定到10000个以上的 m6A峰。转录本m6A的修饰水平受甲基转移酶(编码器)、结合蛋白(读码器)和去甲基化酶(消码器)的动态调控。近年来以m6A为代表的RNA修饰研究成果，证明了RNA修饰动态可逆性调控RNA代谢和加工过程及干细胞定向分化等重要生物学功能。5-甲基胞嘧啶(m5C)是近年来引起广泛关注的另外一种新的修饰类型。 m5C最早发现于tRNA和rRNA中，mRNA中的m5C修饰也已被发现40余年，但对于mRNA中m5C修饰的特征及功能目前并不完全清楚。最初基于重亚硫酸盐处理结合转录组测序的研究发现HeLa细胞中上千个mRNA上的m5C修饰位点。基于m5C抗体免疫沉淀结合重亚硫酸盐测序的研究也鉴定到了古生菌mRNA中的m5C修饰位点，及其保守序列AU (m5C)GANGU。全转录组水平的m5C分布特征及功能研究表明，m5C具有物种和组织细胞特异性。其中，m5C甲基转移酶NSUN2及结合蛋白ALYREF的发现，也充分证明了RNA m5C修饰具有动态可逆性并且能够调控RNA代谢和加工过程及重要的生物学功能。 本综述总结了近年来在RNA甲基化表观转录组学研究中的主要前沿进展，包括发现了RNA去甲基酶、甲基转移酶和结合蛋白，揭示 RNA甲基化修饰调控RNA加工代谢，及其调控正常生理和异常病理等重要生命进程。这些系列研究成果证明RNA甲基化修饰类似于DNA甲基化，具有可逆性，拓展了RNA甲基化表观转录组学研究新领域，完善了中心法则表观遗传学规律。 1.1 RNA去甲基酶(Demethylase) 1.1.1 m6A去甲基化酶FTO 通过体外模拟生理环境下的去甲基化反应条件，将肥胖基因FTO的野生型和突变型蛋白分别与甲基化底物孵育，利用质谱和高效液相技术，对多种甲基化形式进行探索，最终发现FTO对单链RNA上的m6A具有去甲基化功能；同时，在细胞内经高效液相色谱−串联质谱联用(LC-MS/MS)实验验证发现，FTO基因敲低细胞中mRNA中的m6A水平升高，而FTO过表达细胞中mRNA中的m6A水平降低。通过免疫荧光实验证实，FTO在细胞核中呈点状分布。通过与各种细胞核内亚细胞器标志分子共染，发现FTO与核小斑标志分子SC35、U4/U6.U5 snRNA 相关蛋白 SART1、转录酶 RNA PolⅡ有部分共定位。转录抑制后，类似RNA PolⅡ，FTO会聚集到核小斑。这些实验结果证实了FTO催化mRNA上m6A修饰的去甲基化。这一重要发现首次揭示了RNA化学修饰存在可逆性，奠定了 RNA 甲基化表观转录组学研究新领域的理论基础。 此外，近期研究还发现了FTO的其他底物，包括 N6,2’-O-二甲基腺嘌呤(m6Am)和1-甲基腺嘌呤 (m1A)。最新的研究系统阐述了FTO介导的 RNA去甲基化，其中，细胞核的FTO介导m6A的去甲基化，细胞质中的FTO介导m6Am和m6A的去甲基化；此外，FTO还可以结合tRNA，介导tRNA的m1A的去甲基化并进一步影响蛋白的翻译速率。 1.1.2 m6A去甲基化酶ALKBH5 FTO是二价铁/α-酮戊二酸盐依赖型双加氧酶AlkB家族成员之一，该家族其他成员包括ALKBH1-8。这些ALKBH成员是否也具有m6A去甲基酶活性？整合质谱学、细胞生物学、基因组学、生物信息学和模式生物学等，鉴定到 ALKBH5具有催化 m6A 去甲基化活性。在细胞系中敲低ALKBH5，mRNA的m6A水平显著升高；与野生型小鼠睾丸相比，Alkbh5敲除小鼠的睾丸中m6A水平升高；这些结果证明 ALKBH5 类似于FTO，具有催化 m6A 去甲基化活性。通过对雄性Alkbh5 敲除小鼠的表型分析，发现雄性小鼠睾丸变小、生精异常、精子活力受损。利用转录组测序(RNA-seq) 和基因功能聚类分析筛查Alkbh5敲除小鼠的睾丸组织差异表达基因，发现受累基因功能通路涉及精子发生，提示 m6A去甲基化参与调控小鼠精子发育过程。 1.2 RNA甲基转移酶(Methyltransferase) 1.2.1 m6A甲基转移酶复合物核心组分METTL3、METTL14和WTAP 早期研究发现RNA m6A甲基转移酶全酶复合物由至少两个亚复合物MT-A (~200 kDa)和MT-B (~800 kDa)组成，但基于鉴定技术和酶学方法的缺乏，只有 METTL3(~70 kDa)蛋白被鉴定，而该亚基单独是没有酶活性的。因此，具有酶活性的m6A甲基转移酶核心组分的鉴定，是研究m6A调控功能和作用规律的关键。利用串联亲和沉淀结合质谱分析，发现甲基转移酶复合物中的另外两个组分—WTAP和METTL14；结合免疫荧光共聚焦显微镜技术和基于光交联免疫共沉淀技术(PAR-CLIP)的测序技术，鉴定了WTAP和METTL3在细胞内主要作用底物mRNA具有m6A保守基序特征RRACH，发现在WTAP基因敲低的情况下 METTL3和METTL4在负责mRNA加工的亚细胞器—核小斑上的定位信号减少及METTL3结合RNA亲和力降低，提示WTAP作为调节亚基，调控m6A甲基转移酶催化亚基METTL3/METTL14复合物定位和结合mRNA；WTAP和METTL3基因敲低导致斑马鱼胚胎组织分化发育异常以及细胞凋亡的增多。 1.2.2 其他组分 m6A甲基转移酶属于多因子功能复合物，除了催化亚基METTL3，国内外多个实验室鉴定到的多个新组分包括METTL14、WTAP、VIRMA、RBM15和 ZC3H13，这些组分的功能很大程度上是作为调节亚基，调控METTL3在细胞内的活性。METTL3的同源蛋白 METTL16通过动态调控U6 snRNA和靶mRNA的m6A修饰，从而调节细胞内S-腺苷基甲硫氨酸(SAM)水平。METTL16的活性需要UACAGAGAA九聚体和一类特殊的 RNA 结构。 1.2.3 miRNA调控m6A甲基转移酶活性 m6A修饰在mRNA保守序列RRACH中碱基腺嘌呤(A)位点选择性形成。应用m6A抗体免疫共沉淀−高通量测序技术(MeRIP-seq)，可以检测到成熟mRNA中1%~5%的RRACH基序被甲基化，因此这些被甲基化的A位点可能存在选择性机制。利用m6A甲基化测序技术分析了4种不同多能性程度的细胞(胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、神经干细胞、睾丸支持细胞)中mRNA上的m6A修饰图谱，发现m6A修饰具有基因和细胞类型 特异性并且m6A修饰在miRNA靶位点富集。在小鼠神经干细胞(NSC)和人HeLa细胞中，敲低或过表达负责miRNA生成的核酸内切酶Dicer显著影响了m6A水平。在小鼠NSC中过表达或抑制与m6A修饰区域互补配对的miRNA，发现miRNA相应靶标位点的 m6A水平显著升高或降低。利用免疫荧光技术发现Dicer能调控METTL3 的核小斑定位；利用PAR-CLIP技术发现Dicer敲低后，METTL3结合的RNA水平急剧下降；利用 RNA免疫共沉淀技术(RIP)发现miRNA过表达或敲低显著增加或降低了METTL3结合的 miRNA靶标mRNA的水平，说明miRNA通过调控METTL3结合mRNA的能力来调控其m6A甲基转移酶活性。这些研究结果揭示了miRNA通过序列互补调控mRNA甲基化修饰形成这一全新的作用机制及m6A修饰调控细胞重编程命运重要功能。 1.2.4 m5C甲基转移酶NSUN2 为揭示 mRNA上m5C修饰的分布规律和生物学功能，通过优化RNA m5C单碱基测序及分析方法，绘制了人类HeLa细胞系及小鼠6个组织的m5C转录组分布图谱，发现m5C在 mRNA具有物种保守性，显著富集于翻译起始密码子下游以及CG富集区域；而在小鼠不同组织中，m5C修饰具有组织特异性和发育动态性，提示m5C在发育和分化过程中扮演重要调控角色。为鉴定mRNA的m5C甲基转移酶，运用超高效液相色谱−三重四级杆−多重反应检测质谱(UHPLC-QQQ-MRM-MS/MS)技术鉴定并发现了NSUN2是mRNA特异的m5C甲基转移酶，其催化活性依赖于C271 (Cysteine 271) 和 C321 (Cysteine 321)两个半胱氨酸位点；高通量测序分析结果也表明，NSUN2敲低能够显著降低mRNA m5C的修饰水平。 1.3 RNA甲基化修饰结合蛋白 1.3.1 m6A结合蛋白YTHDC1 通过免疫共沉淀结合质谱分析技术，发现定位于细胞核内的m6A结合蛋白YTHDC1与剪接因子SRSF3和SRSF10发生相互作用，提示m6A通过YTHDC1调控mRNA选择性剪接。运用RNA-seq分析，发现YTHDC1、METTL3和SRSF3敲低后，转录本外显子的保留水平在总体上是降低的，而SRSF10敲低后则相反。结合光交联增强型免疫共沉淀及测序技术(PAR-CLIP-seq)进一步分析，发现有m6A修饰的外显子更倾向于被保留。剪接因子SRSF3和SRSF10能够与YTHDC1直接相互作用，并且竞争性的结合YTHDC1。YTHDC1或METTL3敲低后，SRSF3的RNA结合能力以及蛋白的核内定位信号明显减弱，而SRSF10则呈现相反趋势，说明YTHDC1 招募SRSF3到RNA的结合位点，同时抑制SRSF10到RNA结合位点，揭示了m6A在细胞核内通过调控选择性剪接的方式影响转录本。 1.3.2 m6A结合蛋白YTHDF2 2014年，研究人员首次报道了m6A的结合蛋白YTHDF2可介导m6A修饰mRNA的降解。正常条件下，YTHDF2可与脱腺苷酸酶复合物及脱帽复合物蛋白共定位，并且将其靶基因的转录本带入降解小体。随后的研究进一步表明，YTHDF2通过招募CCR4-NOT 脱腺苷酸复合物从而加速m6A修饰的转录本的降解。 1.3.3 m6A结合蛋白YTHDF1 YTHDF1最初被发现可结合到m6A修饰的转录本的终止密码子附近，其整体分布与 m6A修饰非常相似。此外，YTHDF1可与翻译起始复合物直接作用，从而促进m6A修饰的RNA底物的翻译效率。 1.3.4 m6A结合蛋白YTHDF3 定位在细胞质的 m6A 结合蛋白包括 YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3和 YTHDC2。通过串联亲和沉淀结合质谱技术以及GST-Pull down实验，鉴定出YTHDF3和YTHDF1与核糖体40S小亚基和60S大亚基蛋白相互作用。利用新蛋白合成实验，发现YTHDF3可以促进翻译效率，回补实验证明这种现象只能被野生型的YTHDF3蛋白回补，而不能被m6A结合关键位点突变体YTHDF3蛋白回补。PARCLIP-seq结合生物信息学分析发现，YTHDF1和YTHDF3结合基序相似，结合位点都主要位于3′UTR。YTHDF3可以促进 YTHDF1和YTHDF3共有靶基因的翻译效率，提示YTHDF3和YTHDF1协同调控 mRNA翻译效率，揭示了m6A在细胞质内读码器YTHDF3调控mRNA的翻译效率的新机制。此外，通过与YTHDF2直接作用，YTHDF3还可以介导mRNA降解。 1.3.5 m6A结合蛋白YTHDC2 YTHDC2是YTH家族中分子量最大的一个成员，也倾向于结合m6A修饰的保守基序，并增强其底物的翻译效率或降低底物的丰度。此外，YTHDC2还与小鼠精子发生密切相关。 1.3.6 其他m6A结合蛋白 在酵母中，YTH家族的另一成员Mrb1也被报道可结合m6A修饰的RNA。此外，一些基于RNA pull-down的研究检测到了其他的m6A结合蛋白，包括 ELAVL1、FMR1、LRPPRC以及IGF2BP家族蛋白。然而，这些蛋白是否直接结合m6A，以及他们是否是 m6A结合复合物的一部分，还有待深入研究。 1.3.7 m5C结合蛋白ALYREF 为了鉴定m5C的结合蛋白，设计了包含和不包含m5C两种RNA寡聚核苷酸底物，通过寡聚核苷酸富集联合蛋白质谱技术，鉴定到mRNA出核功能复合物组分ALYREF蛋白能够结合m5C修饰的RNA寡聚核苷酸。结合凝胶迁移实验 (EMSA)及RIP结合HPLC和测序技术，发现ALYREF的K171突变能够显著降低其结合m5C的能力，进而降低其与RNA的结合能力。利用荧光原位杂交(FISH)技术，发现mRNA出核效率随着NSUN2和ALYREF的敲低而降低。通过回补实验，发现只有NSUN2和ALYREF的野生型蛋白能够分别回补NSUN2和ALYREF敲低而导致的mRNA出核降低，提示m5C在mRNA出核过程中具有重要的调控作用。 |
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