|
作者：蚍蜉玉 转载请注明：解螺旋·临床医生科研成长平台 一天tRNA急急忙忙找到mRNA告诉他：听朋友圈里说课题组核酸界里多了一个环形的胖子RNA，功能齐全更重要的是可以编码蛋白，mRNA一听，像热锅上的蚂蚁火急火燎的来看看到底这个环形的胖子如何编码蛋白的？ 那么今天分析的文章题目是《Extensive translation of circular RNAs driven by N 6 -methyladenosine》（回复170828可下载，一周有效）。circRNA主要通过反式剪切内含子而来，与mRNA相比其可是去了头又掐了尾，一个非经典的剪切过程。 有大量的报道研究circRNA可以作为miRNA sponges与miRNA竞争性结合mRNA，也被称为ceRNA，从而调控mRNA的翻译和表达。大部分的环状RNA的生物学功能还未曾可知。但是一个有趣的观点是circRNA可以翻译成蛋白，编码蛋白，那么就来看看其是如何编码的吧！ 背景知识普及 N6甲基化（m6A）的基本介绍： （1）m6A 在真核细胞中的表达广泛。 （2）m6A 腺苷的甲基化被甲基转移酶复合物（METTL3，METTL14以及Wilms’ tumor 1相关蛋白）所催化；m6A 可以被脂肪、FTO以及AKLBH5去甲基化。 （3）m6A 能够被YTH家族（YTHDF1, YTHDF12 和YTHDF13）结构域所识别。 （4）含有IRES的环状RNA可翻译蛋白，正如IRES一样，含有m6A的环状RNA中也翻译蛋白。 以下就是文章的主要内容介绍 （一）含m6A 基序的环状RNA可以被翻译 第一：含有m6A 基序的环状RNA能够表达GFP蛋白。 作者早前的研究工作已经发现含有IRES元件的反向拼接形成的环状RNA可表达完整的GFP蛋白，课题组进一步验证该现象时，发现一个惊人的结果：其它三个阴性对照组（不含IRES元件）都可以促进GFP的翻译。为什么会出现这个奇怪的现象，原因是在起始位点附近都包含了RRACH片段，聚集了m6A 序列。 第二：m6A 最近被发现增加信使rna 的翻译效率。 研究观察的结果显示m6A 聚集的RRACH的序列，可能卷入到了环状RNA的起始翻译过程中。 为了验证这个假说，课题组在circRNA报告基因起始密码子之前插入了含m6A 保守基序不同拷贝数的短片段，并检测在293细胞中GFP蛋白的表达量。 如课题组预想的一样，包含一个或者两个基序的circRNA都翻译了蛋白，而且突变的两个基序明显减少了GFP的表达量。另外有一个基序位点的环状RNA与拥有两个的基序位点相比有着同样的翻译效率，表明一个基序位点足够引起翻译，而当circRNA插入空白腺苷酸序列的时候，GFP就不表达了。 另外，课题组也检测了其它两种序列RSV 和RSVns，这两个序列已经被报道可以被m6A 修饰，而且这两种序列可以明显的增加蛋白翻译。更重要的是突变该序列在减少了m6A 的甲基化水平的同时，也同样削减了翻译效率，进一步证明了m6A 能够促使环状RNA翻译蛋白。 （二）环状RNA中m6A 表达水平的变化影响着翻译效率 第一：验证m6A 序列是否一定要被甲基化才能促使环状RNA翻译。 课题组通过m6A 的抗体沉淀了中包含RSV m6A 位点的环状RNA以及SON mRNA的蛋白，但是对照组却不能沉淀下来。包含m6A 序列突变的环状RNA也能被m6A 的抗体沉淀下来，但是翻译效率急剧下降。 这些结果显示，突变能够减少部分但不能完全消减在RSV 位点上的m6A 的甲基化。 第二：共转m6A 的去甲基化酶 FTO显著减少了SON mRNA和circRNA 中GFP的蛋白表达量。 这些都表明具有m6A 位点的circRNA/mRNA是甲基化的，而且环状RNA的翻译需要m6A 的甲基化。 第三：共转m6A 的甲基转移酶METTL3/14可以显著增加 RNA-IP的信号。 在具有m6A基序的环状RNA组和mRNA组中，而在对照组中是没有增加的。同时，环状RNA组中，也显示增加了蛋白的翻译水平。 有趣的是，当单独转染METTL14 时效果是不稳定的，但是当共转METTL3/14时不仅稳定了METTL14而且也诱导了GFP蛋白的翻译，这也可能提供了一个信息：METTL3/14很可能形成了一个复合物。 课题组还发现 FTO 或者 METTL3/14的表达不能够改变环状RNA的水平，表明m6A 的修饰对环状RNA的稳定性不影响。这个观察结果与之前报道的m6A 的修饰促进线性RNA的降解不同，这也从侧面反映了环状RNA有很好地稳固性，m6A 的修饰带来的小的不稳定不明显或者环状RNA的降解与线性RNA的机制不同。 （三）m6A 促使环状RNA的翻译需要哪些蛋白因子的参与 第一：m6A 能够促进环状RNA的翻译需要蛋白因子eIF4G2的参与。 课题组使用稳定的细胞系表达两种eIF4G2的干扰RNA，而后在环状RNA和线性RNA中分别检测编码蛋白GFP的情况。 如所想的一样，eIF4G2敲除的显著减少了环状RNA翻译成蛋白，但是对线性RNA生成蛋白不影响。同样的，去除eIF3A时，eIF3A是eIF3的一个亚基，可与病毒IRES相结合，能够显著减少环状RNA对蛋白的翻译但是对线性RNA没有影响。 第二：课题组探索识别m6A 的蛋白是否是环状RNA翻译蛋白的必须蛋白。 课题组发现通过RNAi技术在环状RNA和线性RNA中都敲除YTHDF1后不能够影响翻译成蛋白，而且YTHDF2敲除后轻度的抑制了GFP蛋白的生成，然而敲除YTHDF3后显著的抑制了环状RNA中GFP蛋白的生成而对线性RNA没有影响，表明YTHDF3是m6A促使环状RNA起始翻译的识别蛋白。 而且通过CO-IP分析YTHDF3可以与eIF4G2相互结合，YTHDF3招募eIF4G2促使m6A翻译蛋白。 以上实验部分已经做了丰富的验证，那么接下来就是计算机的事了 （四）识别内源性含m6A 基序修饰的环状RNA 为了评估细胞中的环状RNA m6A 修饰调节的重要性，课题组进行了测序，并且通过m6A -IP鉴定出13%总环状RNA具有m6A修饰特性。
（五）评估编码蛋白环状RNA在人类基因组中的表达情况 第一：根据以上的观察，课题组开发了一个计算机通道去预测内源性可翻译的环状RNA。 首先在Hs68细胞系中通过耐RNase R性质筛选7771个环状RNA，第一次课题组就筛选出了623个环状RNA 包含m6A 峰值。再用pre-mapped TIS技术又一次筛选出124个环状RNA。最后课题组应用了一个任意长度的开放阅读框进行筛选，筛选出25个环状RNA。在25个环状RNA中与核糖体有关系的。
第二：以上的这些结果促使课题组验证这些具有翻译性质的环状RNA在人基因组信息中的匹配信息。 首先用梯度离心纯化出多蛋白体相关的RNAs，然后将样本用RNaseR消化处理后进行高通量测序。筛选出了250个与多蛋白体相关的环状RNA，只有二十五分之一可翻译的环状RNA被预测到，可能是因为实验方法尚有不足。 当与所有的环状RNA做比较时，发现多蛋白体相关的环状RNA有很少的外显子组成而且基本上都很短；但是具有较长的开放阅读框，这一点与预想的编码蛋白一致。 第三：课题组将单体和多蛋白体相关的环状RNA用荧光定量PCR技术去验证，所选的7个环状RNA是已经确认与核糖体相关。
以上这些结果表明，包含m6A 并具有编码蛋白功能的环状RNA在人类基因组中是广泛分布。 （六）质谱分析环状RNA翻译的肽段 为了直接验证环状RNA编码的内源性蛋白，课题组设计了一个数据库，该数据库包含测序分析出的反式剪切的环状RNA的肽段，而且将这些肽段与蛋白数据库联系起来。结果课题组筛选出33个肽段，但是与蛋白数据库匹配的不是很多。 为了更深一步探索候选的环状RNA编码的肽段，课题组使用化学方法人工合成候选环状RNA编码的肽段然后去进行质谱分析。 结果发现有两个合成的环状RNA的肽段与原始的肽段相匹配，表明经过蛋白质组学鉴定的肽段可能是产生于环状RNA的翻译。这些肽段仅仅是环状RNA编码蛋白质组的一小撮，因为只有肽段测序到反式剪接相连才是环状RNA编码的产物。
如果你觉得文中内容太多，那看看作者呕心沥血作的m6A 促使环状RNA翻译的模式图吧！如下：
m6A 促使的起始翻译需要起始转录因子eIF4G2和m6A 阅读器YTHDF3的参与，增强翻译的是甲基转移酶METTL3/14，抑制翻译的是去甲基化酶 FTO。 |
|
|
