基因组重测序和含SNP候选基因在自身免疫性白癜风史密斯一行鸡模型生物信息学分析

白癜风是一种获得性脱失疾病，特征是外切褪色斑的皮肤黑素细胞的丧失导致。自身免疫已被确定为在白癜风的主要病因，但许多其他因素包括感染，应激，神经异常，异常的黑素细胞的功能，和遗传易感性有牵连[1]。在史密斯线（SL）鸡是唯一的动物模型的自身免疫白癜风自发显示人类疾病的所有临床和生物学表现[2，3]。像其他自身免疫性疾病，SL白癜风（SLV）是多因素性质，包括遗传，免疫系统，和环境因素的相互作用。SLV敏感性表现在部分中的固有缺陷的黑素细胞和黑素细胞的损失是由于黑素细胞特异性细胞介导和体液免疫活性[2，3]。

最近全基因组关联研究（GWAS）在人类理解遗传组分中的各种自体免疫疾病，包括白癜风的作用已经确定数百位点携带风险等位基因的[4]。一些GWAS结果确定在人群中[白癜风易感基因位点5 - 10]。然而，确定GWAS结果最易感基因座中发现基因表达调节区，因此所识别的关联不足以确定的因果基因或推断引起的风险的变体，它一般不诱导深刻变化的基因的改变（例如，编码序列改变，缺失或重复）。最近，哺乳动物物种的DNA元件（ENCODE）的百科全书表明?90％的疾病相关的遗传变异在人类在于非编码区，而只有约10％的变化编码区是与人类疾病有关[致病突变11，12。然而，潜在的编码基因突变的鉴定是改变蛋白质的功能是一个先决条件的过程，了解疾病的病因。此外，候选人的遗传风险因子的功能研究几乎是不可能的，没有合适的模型系统。

对SL鸡是一个极好的模型，进行候选基因所依据遗传易感性白癜风由于易于处理，明确的表型，高白癜风发病人口（80-90％），在体内表征的可行性的功能验证研究和相对短的生成时间。近日，微阵列分析SLV开发过程中检测全基因表达，并提供在该支持的白癜风[的多因素病因学的转录水平的综合信息13]。在这项研究中，进行使用的Illumina平台全基因组测序分析，以更加深入地调查在用鸡亲布朗线（BL），从该最初求出SL比较SLV表达的遗传方面。BL鸡保留白癜风易感性，但具有非常低的（0 - 2％）发生率的白癜风发展速率[2，3]，尽管没有在本研究中使用了BL鸡有白癜风。数以百万计的单核苷酸多态性（SNP）是由基因组再测序鉴定并仅潜在因果含有非同义突变可引起氨基酸改变在蛋白质在本研究集中于基因。

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结果与讨论

基因组测序的BL和SL鸡

汇集DNA的10个非白斑BL和SL鸡基因组测序各有证实SLV产生?63和89000000序列读取200个基点，分别为（见表  1）。这些中，约80％的读取被用于序列比对，而序列的20％的读取未对准。因此，基因组覆盖BL和SL打进红原鸡鸡基因组的5.1倍和7.0X，分别。SNP的总数为4.8和5.5亿美元（?0.5％的模板基因组），用于对BL和SL基因组中，分别大量每检查鸡线SNP的是根据对至少2个读覆盖深处（每核苷酸位置读计数数）的数据。（数据未显示）的SNP大多数被发现在较大的染色体（CHR），包括CHR 1至5和Z（性染色体）。为了鉴定基因的生物标志物是负责SLV的发病率，独特的SNP存在于SL，只有通过除去的SNP与该亲BL发现重叠被选定。然后，用突变≥75％SNP率被选为可靠标志的SNP。由于本研究的目的是确定突变单核苷酸多态性唯一发现SL相比父母的BL，使用的过滤过程中没有涉及到以质量分数（在其他个文件Q通话列一个典型的SNP呼叫和过滤方法1：表S1 ）[14]。相反，SNP过滤通过除去两个BL和SL发现重叠的SNP，并应用如在方法中描述的固定％的SNP率（≥75％）下进行。其结果是，共约1万独立个SNP被鉴定整个SL鸡基因组（图  1）。超过10万个SNP被发现在CHR 1，2，3，和Z而人权委员会32不包含任何独特的SNP位点为SL。当单核苷酸多态性通过染色体区域的特征类型分组，?SNP的50％是在基因间（异）区和13710个SNPs中发现CDS序列（蛋白质编码区）（图  2）。也观察到大部分含有单核苷酸多态性中的调节区，而不是在CDS区的基因，确定人类GWAS研究，以包含在当前SL研究独特的SNP（数据未显示）。周围的蛋白质60％SL SNP的编码CDS地区是同义突变，没有引起氨基酸改变。来识别潜在因果突变诱导蛋白编码的改变，SNP分析集中在SNP导致改变的氨基酸序列。使用这种方法，总共3518个SNP被鉴定，可以诱导非synonymous-，frameshift-，无义，和无启动变化在CDS区域（图  2和附加文件1：表S1），这表明3518 SNP是功能性蛋白编码区的遗传成分，可能会推动SLV的发病率较高的一部分。了与氨基酸改变相关的3518个SNP的候选，SNP位点的表示≥10读深度（被认为是更可靠的候选基因标记）被选择用于进一步的分析。使用这种方法，195个SNP保持（数据未显示）。为了减少由于在组装过程中可能出现的错误误报，重新扫描的195可能更可靠蛋白质编码SNP是使用Seqman-Pro的浏览器程序进行每个SNP位置的。这个过程产生了156被选择作为候选的SNP标记物用于进一步分析（表更可靠的SNP  2）。

表1

Illumina的测序和装配的结果

图1

发现在白斑SL鸡相比，非白斑BL鸡每染色体独特的SNP编号。编号指示用于酒吧不清晰可见。

图2

在SLV SNP的总结。A）中的SNP通过染色体区域在SL中鸡分类数。B）的单核苷酸多态性通过氨基酸序列改变类型分类的数量。

表2

诱导出的氨基酸变化的156可靠的单核苷酸多态性标记≥10读深处

采用PCR和Sanger测序SNP验证

因为被用于基因组测序的10只鸡为每个行合并的DNA样本，从个人的SNP，进行了验证过程具有较大的鸟类种群。为此，14个SNPs随机抽取的156个候选单核苷酸多态性标记显示≥10读取深度选择并经受用PCR和Sanger测序检测SNP位置具有较大的鸟类数量SNP验证分析; 特别是20个非白斑BL鸡和70 SL鸡参展白癜风。结果清楚地显示，在BL和SL鸡（表之间的14个SNP的位置的核苷酸碱基的频率差  3）。因此，156个SNP已知可引起氨基酸改变可以成为潜在的遗传标志物白癜风SL鸡。

表3

在更大的数字非白斑亲BL（20）与白斑SL（70）鸡用PCR和Sanger测序14个SNPs验证

生物信息学分析含有氨基酸改变的SNP基因

氨基酸变化可能会对在SL鸡白癜风感应功能的解释的影响。别出心裁途径分析（IPA）程序生成的生物信息数据集，包括官能团（基因本体论; GO）和基因网络的含SL鸡氨基酸改变的基因。在156个SNP被发现在139个基因包含known-和未知的功能，染色体开放阅读框，并假定蛋白（附加文件2：表S2）。

功能性角色

基因被归类在76官能团（附加文件3：表三）。其中，有6官能团是特别感兴趣的自体免疫白癜风发展，包括皮肤疾病/病症，炎性反应，炎性疾病，免疫性疾病，免疫细胞的运输，和感染性疾病（表  4）。基因皮肤病/条件的官能团包含下列基因：ADAMTS13（ADAM金属肽与血小板反应蛋白1型基序13）; ASPM [ASP（异常主轴）同源，小头畸形有关; 果蝇）]; ATP6V0A2（ATP酶，H +运输，溶酶体V0亚基A2）;BRCA2（乳腺癌2，早发性）; COL12A1（胶原蛋白，第十二型，α1）; GRM5（谷氨酸受体，代谢型5）; LRP2（低密度脂蛋白受体相关蛋白2）; MKI67（增殖Ki-67的的标志）; OBSCN（obscurin，细胞骨架钙调蛋白和肌联蛋白相互作用RhoGEF）; PLAU（纤溶酶原激活剂，尿激酶）; RNF168（环指蛋白168，E3泛素连接酶蛋白）; STAB2 [stabilin 2或FEEL2（fasciclin EGF样，层粘连蛋白型EGF样，和连杆结构域的清道夫受体2）]; 和XIRP1（新肌动蛋白结合含1重复）。一般与皮肤病相关的功能为这些基因列于表  5。

表4

候选基因的白癜风相关的功能

表5

含CDS区域的SNP相关皮肤疾病/条件的候选基因的功能

有趣的是，由尼古拉耶夫等人最近的一份报告。（2012）[17] 表明，ASPM，LRP2，STAB2发现氨基酸的变化，并XIRP1蛋白质与人类黑色素瘤通过外显 ??子测序相关。在黑素细胞白癜风还表现出形态学和生物黑素缺陷/改变与从正常色素沉着[个人黑素细胞29]。而这些改变可能与在黑色素瘤，如生长缓慢，更高的灵敏度观察到培养的黑素细胞的氧化应激不同[30，31]，改变在氨基酸序列中同源的蛋白质，但不同的残基发现可能会导致皮肤的相对的表型疾病/条件[32]。除了 ??这些分子，BRCA2，GRM5，MKI67，和OBSCN与SLV关联也已知与人黑素瘤相关联。候选基因和其它皮肤病包括黑素瘤之间的关系总结于表  5。

基因网络

基因网络分析，这代表了一种基于功能性知识投入相互作用的基因之间的分子间的连接，对基因与使用IPA计划SLV鸡氨基酸的变化进行。的基因网络分析进行了使用35聚焦分子的最简单的设置，以方便和总结分子间连接（表  6和图  3，4，4，5，5，6，6，7，7，8，8，和and9）。9）。7基因网络的讨论下面提供并为每个网络中焦点分子基因信息列于附加文件4：表S4。

表6

候选基因的相关联的网络功能

图3

基因网络＃1。中重要的核心分子，分子间的相互作用被显示。灰色符号显示在SNP的列表中发现的基因，而白色符号表示相邻的基因，其功能关联的，但不包括在内，在该基因 ...

图4

基因网络＃2。分子相互作用和符号是同图的描述  3。

图5

基因网络＃3。分子相互作用和符号是同图的描述  3。

图6

基因网络＃4。分子相互作用和符号是同图的描述  3。

图7

基因网络＃5。分子相互作用和符号是同图的描述  3。

图8

基因网络＃6。分子相互作用和符号是同图的描述  3。

图9

基因网络＃7。分子相互作用和符号是同图的描述  3。

在网络＃1候选基因与有丝分裂原活化蛋白激酶的信号传导途径有关（MAPK;还ERK1 / 2），蛋白激酶C（PKC），连接到VEGF（血管内皮生长因子）和PDGF（血小板衍生的生长因子）与PLAU在中心（图  3）。有关网络＃1的顶部功能是心血管疾病，血液病，和心肌梗塞。有趣的是，分子，包括LRP2，PLAU，ADAMTS13和GRM5是网络＃1的部分也被确定为功能性因素，黑色素瘤上述[如17]。MAP2K1和MAP2K2的遗传突变黑素瘤患者[诱发另外，在LRP2的氨基酸序列的突变，改变功能17在GRM5在小鼠黑素瘤模型[]，和突变20]也报告了。因此在网络＃1的连接表明产生在LRP2，PLAU，ADAMTS13的氨基酸改变的基因突变，且GRM5可能影响皮肤的疾病，包括白癜风，通过MAPK和ERK1 / 2信号途径。

的网络＃2的顶部功能包括细胞周期，DNA复制，重组和修复，发育障碍（图   4）和网络＃3是参与发育障碍，内分泌系统紊乱，遗传性障碍（图5）。大多数分子在网络＃2和＃3直接结合对UBC（泛素C）。泛素化，共价连接的泛素蛋白质，调节许多细胞过程，如蛋白质的降解和信号转导。最近，许多ubiquitinylated蛋白质和赖氨酸的泛素化站点被确定使用蛋白质组学技术在哺乳动物物种[33 - 37]。的确，在SLV，为CEP192（中心体蛋白192 kDa的; pK169R）中赖氨酸残基的氨基酸的变化和API5（细胞凋亡抑制剂5; pK1219Q）被确定（表  2），这表明不同的细胞功能包括蛋白降解改变泛素化蛋白质的性质可能在治疗白癜风的感应一个显著作用。

在网络＃4分子参与细胞形态学，细胞功能和维护，头发和皮肤的发展和功能（图  6）。在网络＃4分子主要是与IFNG（干扰素γ），IL-4（白细胞介素4），MAPK8，和钙信号传导途径相互作用除了蛋白磷酸酶（PPP1CA;蛋白磷酸酶1的催化亚基α同功酶）的功能。MYO16（myocin 16），KIF18A（驱动蛋白家族成员18A），和CASC1（癌易感候选1）是已知的直接结合到PPP1CA [38 - 40]，提示在这些蛋白质的氨基酸变化可能诱发的改变（超VS海波）蛋白质磷酸化状态的SL鸡，导致白癜风的发展。分子IFNG，IL4，MAPK8和钙信号传导途径相互作用呈间接关系，而不是与对方使得难以解释在这些分子的氨基酸变化如何影响SL鸡白癜风感应的直接关系。

在网络＃5分子也主要是绑定到UBC在网络讨论＃2，＃3和功能包括脂质代谢，小分子生物化学，消化系统发育和功能（图  7）。

网络＃6包含涉及遗传性疾病的分子，眼科疾病，神经系统疾病（图  8）。在这个网络中，ZC2HC1A（锌指，含1A C2HC型）和RUFY3（RUN和含有3 FYVE结构域）直接结合的APP [amyloideβ（A4）前体蛋白。APP是前体蛋白对β-内amyloide，它是淀粉样蛋白斑的阿尔茨海默病的患者[大脑的主要成分41]。RUFY3（也称为单轴突有关; singar1），这是一种脑特异性蛋白，通过抑制形成过剩轴突[调节的神经元极性42]。虽然ZC2HC1A和RUFY3对APP的结合阿尔茨海默病[的进展期间，发现41]，对于本在此疾病的进展结合功能角色尚未表征。同样，在ZC2HC1A和RUFY3发现氨基酸变化有牵连的SLV发展可能作为改变的APP结合性质的结果。USH2A [Usher综合征2A（常染色体隐性遗传，轻度）]被列入网络＃6。在USH2A各种突变已确定在Usher综合征II型，其特点是中度至重度感音神经性聋和进步的视网膜色素变性[例43]。白斑SL鸡也可能发展严重视力障碍和失明由于针对脉络膜黑色素细胞和随后的损坏视网膜色素上皮细胞的自身免疫活性。[44，45]。综合来看，在USH2A氨基酸的变化也可能会影响白癜风的进展和视网膜色素脱失。

分子在网络＃7主要功能的细胞反应来治疗，细胞大会和组织，DNA复制，重组和修复。PRKDC（蛋白激酶，DNA的活化，催化多肽）和其相互作用的蛋白激酶是主要参与此网络（图  9）。除了 ??敲除自身磷酸化能力的和不活动的突变，改变由单个氨基酸PRKDC的变化已经知道影响再结合的DNA在哺乳动物细胞中的双链断裂[46]，提示白癜风发展可能受异常PRKDC激酶活动由于观察到的氨基酸的改变。

白癜风易感基因座在人群中确定了几个GWAS [5 - 10]也显示几个位点，在各种蛋白质诱导的氨基酸的变化，如STRN3（Striatin，钙调蛋白结合蛋白3），DNAH5（动力蛋白，轴丝，重链5）， KIAA1005（免疫球蛋白重链可变3），TYR（酪氨酸酶），OCA2（眼皮肤白化病II），PTPN22 [蛋白酪氨酸磷酸酶，非受体型22（淋巴），IFIH1（干扰素诱导解旋酶C区1），SLA（SRC -like-适配器），CD44，MC1R [黑皮质素1受体（阿尔法黑素细胞刺激激素受体 ??）]，UBASH3A（泛素相关联，并且含有A）SH3结构域，C1QTNF6（C1Q肿瘤坏死因子相关蛋白6），CASP7（胱天蛋白酶7）和GZMB（粒酶B）。一个类似突变UBASH3A蛋白编码来自人区[6]还发现在SLV鸡模型（表  2）。此外，当被认为是3518的候选氨基酸改变的SNP（读取深度<10）的长长的名单，几个基因，包括IFIH1（干扰素诱导解旋酶含C结构域蛋白1），CD44抗原和DNAH5（动力蛋白，轴丝，重链5），匹配那些确定人类GWAS研究[附加文件1：表S1和[5，6]，虽然氨基酸位置和改变不匹配。UBASH3A是属于T细胞泛素配体（图拉）家族两个家族成员之一，可以T细胞信号传导[负调控47]。连同本文其他地方讨论的UBC分子，相关的UBASH3A功能，泛素化和T细胞信号转导通路可能是SLV发展很重要。IFIH1编码参与抗病毒的先天免疫反应的干扰素诱导的RNA解旋酶，1型糖尿病，格雷夫斯病，多发性硬化，银屑病相关联，并且或许狼疮[48 - 53]。CD44编码的细胞表面的糖蛋白具有各种功能，包括在T细胞发育[角色54]，并与狼疮相关[55]。DNAH5基因突变是原发性纤毛运动障碍（PCD）[发现56]，传播作为一种常染色体隐性遗传性状和特征是由于不正常的纤毛结构和功能反复呼吸道感染一种罕见的疾病。在感觉和运动纤毛的结构和功能主要缺陷导致多个ciliopathies [57]。

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结论

在这项研究中，各种潜在的遗传标记表示的氨基酸变化被确定在通过基因组重测序SLV模型。当考虑基于所涉因子的解释功能，白癜风发展似乎与间骨架因子（OBSCN，ASPM，XIRP1，ADAMTS13），蛋白激酶（MAPK，ERK1 / 2，PKC，PRKDC），磷酸酶的相互作用（相关PPP1CA），泛素化（UBC）和淀粉状蛋白（APP）的生产。进一步的功能验证研究，如在候选基因的SNP位点在参与SLV发展靶组织等位基因特异性表达将使用SL鸡模型自发自身免疫性白癜风进行。

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方法

动物和Illumina的测序

成人SL鸡白癜风患者和父母非白斑BL鸡，在阿肯色大学（费耶特维尔，AR）由G. ERF维护，从饲养员的人群选择。血（3毫升）各12鸟类以下批准阿肯色州机构动物护理和使用委员会大学的动物使用协议收集（IACUC;批准文号：11019）。基因组DNA，从每个全血样品中使用的QIAamp DNA迷你试剂盒（Qiagen，Hilden的，德国），按照制造商的说明分离。脱氧核糖核酸质量通过琼脂糖凝胶电泳确定，并具有在每行中的最高质量的10个样品被汇集到代表每一行。（;圣达菲NCGR）图书馆准备和Illumina的基因组测序的合并的DNA样本是由国家中心的基因组资源进行。Illumina的HiSeq系统2×100 bp的配对末端读取技术被用于基因组测序。

基因组序列装配和数据分析

从收到的NCGR Illumina的测序数据进行比对，以红原鸡（GBK 4.0）从NCBI检索的鸡的参考基因组序列。对于基于参考基因组比对，该LASERGENE软件（DNASTAR，麦迪逊，WI）的NGEN基因组序列组装程序使用。大会参数如下：文件格式，BAM; 聚体大小，21; 滨海跳过查询，2; 最低匹配百分比，93; 最大的差距大小，6; 最小排列长度，35;比赛得分，10; 错配罚分，20; 缺口罚分，30; SNP计算方法，二倍体贝叶斯; 最低SNP个，5; SNP置信度阈值，10; 最小的SNP数，2; 最低基础质量得分，5装配后，LASERGENE包的SeqMan Pro程序用于进一步的分析，包括单核苷酸多态性数据。

SNP检测和分析

JMP基因组学（SAS软件研究所，公司，卡里，NC）程序用于过滤白癜风SL鸡独特的SNP。SNP位点发生在两个SL和BL线被过滤掉了，留下的每一行独特的SNP。要确定固定的高度和纯合SNP位点，基于SNP百分比（SNP％）的SNP进行过滤。被选择为≥75（％）的SNP的SNP％（例如，数SNP = 3阅读深度= 4的）。的75％的截止用于SNP选择是考虑，可以采用大规模并行测序方法来产生潜在测序错误设定。潜在因果SL的SNP诱导CDS区域的非同义改变被选择用于进一步分析。由于许多SL SNP的阅读深度是低的，独特的单核苷酸多态性显示≥10阅读深度被认为是可靠的单核苷酸多态性。可靠和因果的SNP，其被选择以上述条件用双检查与对准视图原始组件数据，以减少假阳性证实。

采用PCR和Sanger测序SNP验证

十四随机选择的SNP，其诱导在CDS区的氨基酸变化，使用PCR和Sanger测序较大SL和BL鸡数经受验证。二十BL和该进行了验证表型为非白斑和白斑70 SL鸡，分别用于血液采样。约血100微升从每只鸟被翅静脉穿刺到含有柠檬酸（抗凝血剂）试管收集。基因组DNA从使用Wizard SV 96的基因组DNA纯化系统的全血中分离（Promega公司;麦迪逊，WI）中依照制造商的经过修改的指令。使用NanoDrop 1000分光光度计（赛默飞世尔科技公司，沃尔瑟姆，MA）和稀释度为1毫微克分离的DNA进行定量/μL制备96孔PCR格式对于所有样品。使用引物3在线软件（表：PCR反应中，正向和反向引物基于所述RJF基因组序列（GenBank登录GCA_000002315.2装配标识）设计  7）。测序引物被设计以退火至少50碱基对的SNP位置的上游和正向/反向引物被选择在指定seq引物和SNP位置的侧翼区。所有的引物，由商业综合DNA技术（埃姆斯，IA）合成。进行PCR以25μL的反应体积在96孔板用cyle条件如下：变性95℃1分钟，扩增（95℃30秒，55-63℃，1分钟，72℃的40个循环℃1分钟），最后延伸72℃10分钟。通过1％琼脂糖凝胶电泳进行的PCR验证。（;麦迪逊，威斯康星Promega公司），按照制造商的说明将PCR产物使用Wizard SV 96的PCR净化系统纯化。简要地说，四个板块（四种不同的PCR产物）合并成一个板，被进行PCR清理。跨特异性序列引物四个汇集PCR产物进行了检查，BLAST功能（NCBI），而不是交叉的具体与其他序列引物汇集只产品。纯化的PCR产物进行由阿肯色州DNA资源中心大学（费耶特维尔，AR）进行Sanger测序。结果是使用ABI序列的扫描仪软件（Life Technologies公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州）进行分析。记录的SNP位置存在的碱基比率。

表7

用于PCR和Sanger测序引物

生物信息学

139个基因显示≥75SNP％的功能解释，≥10阅读深度和非同义的变化是在基因本体和使用Ingenuity通路分析（IPA分子网络的背景下进行分析;心灵手巧系统公司;HTTP：//www.ingenuity。 COM）。因为IPA是基于人类和小鼠的生物信息学，差异表达的基因在鸡的功能主要基于哺乳动物生物学机制被解释。在网络中的分子数的上限设定为35，仅基于每个焦点基因对其他显著（具有与数据库中的其他基因的直接相互作用上传显著基因的一个子集）的连接数留下的最重要的分子基因[58]。

可用性支持数据

所有序列中的原稿读取描述可在BioProject加入PRJNA256208。Illumina的序列读取被存放于在下列电话号码NCBI的SRA档案（SL：样品：SRS670088，实验：SRX665272，阅读：SRR1531502; BL：样品：SRS670098，实验：SRX665286，阅读次数：SRR1531503）。

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电子辅助材料

附件 1：3518 的SNP列表诱发氨基酸变化SL鸡 。（XLSX 432 KB）（432K，XLSX）

附件2： 基因名和139基因显示含有氨基酸改变功能≥。在SL鸡深度10计数 基因符号，Entrez基因名，细胞位置和类型提供的。（XLSX 18 KB）（18K，XLSX）

附加文件3： 含有氨基酸改变的基因功能组 （XLSX 12 KB）（12K，XLSX）

附加文件 4：。焦点分子基因网络列表基因符号和基因的Entrez名字被显示网络分析的插图。（XLSX 17 KB）（17K，XLSX）

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致谢

这项工作得到了阿肯色州生物科学研究所和阿肯色州农业实验站的支持。

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脚注

利益争夺

作者宣称，他们有没有竞争的利益。

作者的贡献

HMJ进行的实验，分析数据，并写了稿子。GFE维护动物模型，编写了BL和SL的血液样本，并编辑稿件。九广铁路准备从血液，设计引物的DNA样本，进行PCR和Sanger测序反应。BWK设计实验，进行实验和撰写文章。所有作者阅读并同意最终的文本。

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投稿人信息

贤敏张，电子邮箱：ude.krau.liame@gnajh。

吉塞拉?FERF，电子邮件：ude.krau@frefg。

王小强?罗兰，电子邮件：moc.liamg@001dnalworeelyak。

秉WHI岗，电子邮箱：ude.krau@gnokb。

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