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一、药敏实验在临床诊断中应用意义： 1、在畜牧产业中，各种细菌性疾病很容易给养殖业造成经济损失，使用抗生素防治细菌性疾病成为经常性工作。但在养殖过程中不科学的、盲目的滥用抗生素，造成细菌产生耐药性问题正变得越来越突出，使抗菌药的疗效降低，疗程延长，还使死亡率升高和治疗费用增加，给养殖业带来巨大经济损失。 2、耐药菌株还可能将耐药性基因由动物转移给人类，对人类健康造成潜在威胁。如何避免滥用抗生素，药敏试验在临床诊断中的应用就显得重要了。 3、药敏实验可以相对快速有效地检测病原菌对各种抗菌药的敏感性，指导临床合理用药、灵活选药。可以在本地区容易买到的药品中选出最敏感的药物，既能缩短病程，又能避免盲目用药，减少费用。 4、因为药敏实验在动物体外进行，操作相对简单，成本相对较低，既经济又快速有效，可以对流行病学调查进行监控，控制和预防耐药菌株的流行，在生产中具有非常重要现实意义。 二、药敏试验的步骤： 1、琼脂平板制备 按照营养琼脂干粉说明来进行稀释，稀释后琼脂放在微波炉里进行加热，加热后琼脂移至超净工作台中，静置待温度降至50℃（手指能接受的最高温度）左右时，开始倒平板，内径225px平皿每个平皿倒入约10ml琼脂液，倒入后迅速混匀铺满平皿底部。 2、药液制备：按药品使用说明书上的配料或饮水浓度配置按1g需加多少毫升水或配多少毫克饲料，就相当于配制药液所加蒸馏水的毫升数。如10g药物可配50kg饲料，其换算方法为：1g本品加5000ml蒸馏水。此溶液液即为用于做药敏试验的药液。 3、药敏纸片制备：要用质量较好的定性滤纸，用普通的打孔器打成直径6mm的圆形小纸片。取圆纸片50片放入清洁干燥的小瓶或小平皿中，以单层牛皮纸扎口或包扎。经15磅15-20分钟高压灭菌后，置于37℃温箱或烘箱中一天，使完全干燥。按每张纸片饱和吸水量为0.01ml计，在上述含有50片纸片的小瓶内加入药液0.5ml，不时翻动，使滤纸片将药液均匀吸净，一般浸泡30分钟即可。同时在记录药物名称，于37℃温箱过夜。在温箱或烘箱中的时间不宜过长，以免某些抗生素失效。青霉素、金霉素宜在低温下真空干燥。干燥后即密封。切勿受潮，置阴暗干燥处或家用冰箱中保存，有效期4-6个月。 取新鲜病料组织于超净工作台中或酒精灯旁，剪取新鲜组织断面无菌涂抹到营养琼脂板上，涂布整个琼脂平板表面，反复涂布几次，保证涂布均匀。 5、贴药敏纸片 用无菌镊子将纸片放于固体培养基表面并轻压，使纸片与培养基表面完全接触。为了能准确观察结果，要求药敏纸片均匀分布于培养基上，位置安排适中，防止出现抑制圈重叠。一般各纸片中心相距应大于24mm，可在平皿中央贴一片，外周等距离贴7－9片。记住每种药敏纸片的名称。 6、温箱培养 贴完药敏纸片的平皿倒放在37℃恒温箱中培养24小时以上。 三、药敏实验结果观察 四、药敏实验选药原则 1、在选择高敏药物时还应考虑药物的吸收途径。因为药敏试验是药液直接和细菌接触，而在给畜禽用药时，必须通过机体的吸收才能使药物发挥疗效，所以在给畜禽用药时，高敏药物一定要配合适宜的给药方法，并予以足够剂量、足够疗程，才会取得好的治疗效果。 2、药敏试验结果仅为临床选择高敏药物的参考。因动物机体及环境等因素影响，药物的药敏试验与临床治疗效果的符合率一般为70－80%，所以也不能过分地依赖药敏试验。如发现疗效不显著应及时换药。 3、药敏试验确定的首选药物不是一成不变。随着药物使用频率的增加及新特药的不断出现，细菌对原先的高敏感药物可能不再敏感。因此，定期进行药敏试验了解本场细菌对抗菌药的敏感性情况是很有必要的。 4、窄谱抗生素能解决的问题不选广谱抗生素，一种抗生素可达到治疗作用时，不要用两种药物联合应用。必须应用两种抗生素时，应选择联合应用具有协同作用的药物。 5、避开已经使用过的药物或其同类药物，发病期间已用过的药物或同类药物一般不用。 五、药敏片的制作 药敏片一般可以由厂家提供，也可以自己制作，制作药敏片直接选用各药厂的成品药来做。 制作药敏片设备和器皿：需要恒温箱、平皿（直径90mm或更大一点的都行）、烧杯、蒸馏水、滤纸、打孔器。 具体的操作步骤： 1、将滤纸用打孔器打好适量直径为6mm的小圆纸片。 2、将所需培养皿或玻璃小瓶、玻璃棒、微量吸管、镊子、滤纸、滤纸片等进行高压灭菌，一般121℃，0.15帕斯卡，15~20min。 3、在烘干箱或恒温箱内37～60℃，放置12～24小时直至烘干。 4、将要选的药用蒸馏水按药品使用治疗量的比例配制成药液，按5ml药液30~40个小圆纸片浸泡。 5、将浸泡好的药敏片用镊子夹出，放到另一干燥平皿中，注意药敏做的多时，放湿药敏片不要完全重叠地放。这样会使有的药敏片在干燥过程中所沾的药量不一，影响您对药的评价。因为有的药不溶，药厂会加一些助溶剂，干燥过程中有的药会析出。这时药敏片叠放位置会影响所沾的药量的。 6、将盛湿药敏片的平皿放到恒温箱中，温度37℃，放置12～24小时，不同的药干的时间也可能不一样，所以自己需要视情况而定。在这个过程中要注意勤翻一下药敏片，尽量不要让它们沾在一起。 7、药敏片的储藏：将烘干的药敏片分装，标上药名和日期，储存要注意防潮。短期可4℃冷藏保存3～6个月，长期要-20℃冷冻保存。 六、培养基的制备： 兽医临床上一般用营养琼脂培养基。 将成品营养琼脂培养基粉按说明取适量，加蒸馏水溶解，放入高压灭菌锅，121℃灭菌15～20min，冷却到50℃左右，倾注到已灭过菌的培养皿中，厚度约5～6mm，冷却凝固后使用或放入4℃冰箱中备用。 七、接种细菌： 在对病死畜禽解剖时，切取一小块肝、脾等器官，使用新鲜创面在培养基上涂满，操作时就避免感染其他杂菌。 八、粘贴药敏纸片： 将镊子于酒精灯火焰上灭菌后略停，取药敏片贴到培养基表面。为了使药敏片与培养基紧密相贴，可用镊子轻轻按压几下药敏纸片。每个培养皿所用药敏纸片的数量和分布可根据培养皿的大小确定，一般采用中央贴一片，周围等距离贴5至6片。 九、培养细菌： 将贴上药敏纸片的培养基置于37℃恒温培养箱中培养12～18h，观察抑菌圈大小，判定结果。 在涂有细菌的琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散，其浓度呈梯度递减，因此在纸片周围一定距离内的细菌生长受到抑制，形成抑菌圈。按抑菌圈直径大小判定敏感度高低，一般抑菌圈直径在20mm以上为极敏，15～20mm为高敏，10～15mm为中敏，10mm以下为低敏，无抑菌圈为不敏。 十、指导用药： 做药敏试验之后，应选择高敏药物进行治疗，也可选用两种药物协助使用，以减少耐药菌株。 因为药液必须通过机体吸收才能达到一定效果，所以选用高敏药物同时，还应考虑药物的吸收途径，配合适宜的给药方法，才能达到更好的治疗效果。 十一、注意事项： 为了使试验结果安全可靠，要注意以下几个影响药敏结果的因素： ①同一平板上细菌接种量应恒定，如太多，抑菌圈变小； ②药物的浓度和总量直接影响抑菌圈的大小，需严格按治疗量配制，且用吸水性好的药敏片均匀吸附； ③一般培养细菌的条件为37℃，12～18h，有些抗菌药扩散慢如多粘菌素，可将已放好抗菌药的平板先4℃冰箱内2-4小时，使抗菌药预扩散，然后再放37℃温箱中培养； ④整个过程要保证无菌操作。 |
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