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作者：于新友，李天芝，李 峰，等 猪圆环病毒(PCV) 是圆环病毒科、动物圆环病毒属的成员。该病毒科是国际病毒分类委员会(ICTV) 第6 次学术报告会新命名的一个科，是目前已知能自行复制的最小的哺乳动物病毒。PCV可以分为PCV1 和PCV2 两种血清型。PCV1 无致病性，但广泛存在猪体内及猪源代细胞系，1974 年，Tischer 首次从PK-15 猪肾传代细胞系中分离。PCV2 具有致病性，该病主要以进行性消瘦和多系统病理损伤为特征，可引起断奶猪和育肥猪生长缓慢、呼吸急迫、消瘦、贫血、出现黄疸现象，剖检后发现有淋巴结肿大、肝硬变、多灶性黏液性气管炎、间质性肺炎和肾炎，给养猪业造成相当严重的经济损失。1991 年，在加拿大首次暴发该病，随后，世界各国和地区都有该病的报道，并在患断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎和肾病综合征(PDNS) 等病猪体内分离到PCV2，并证明PCV2 与这些严重威胁着养猪业的疾病密切相关。目前该病毒引起了国内外兽医界的广泛关注。 猪圆环病毒（PCV）是一种小的均匀对称的二十面体球形病毒、无囊膜、大小（17±1.3）nm。PCV1 的病毒结构蛋白为36 ku，而PCV2 的病毒结构核酸组成。PCV 在CsCl 中的浮密度为1.37 g/cm3，沉降系数为52 S，分子质量为580 ku。PCV 对外界的抵抗力较强，在pH 为3 的酸性环境中很长时间不被灭活。该病毒没有囊膜，对氯仿等有机溶剂不敏感，在56 ℃或70 ℃氯仿处理一段时间，不被灭活。在高温环境（72 ℃）也能存活一段时间。PCV 不具有血凝活性，不能凝集牛、羊、猪、鸡等多种动物和人的红细胞。 PCV 在原代胎猪肾细胞、恒河猴肾细胞BHK-21 细胞上不能生长，PCV2 可在Vero 细胞中繁殖复制，最初生长不佳，但随着代次的增加，生长状态逐渐变好。PCV 通常在PK-15 细胞内增殖，由于PK-15 细胞系中常污染有PCV1，且无论是PCV1 和PCV2都不形成CPE，所以在选择用于PCV2培养的细胞时，必须事先进行检测。 PCV 基因组为单链环状DNA 分子。PCV1 基因组长度为1 758 或1 759 bp，而PCV2 为1 767 或1 768 bp。两者之间仅有68% 的序列同源性，而PCV2毒株之间序列同源性均95% 以上。PCV基因组最惊人的特点就是出现互相嵌套的开放阅读框(ORF)。计算机软件预测PCV2 基因组中可能含有11 个开放阅读框。PCV11 个ORF 中只有ORF1和ORF2 的长度超过600 bp。PCV1 和PCV2 的ORF1 和ORF2 大小几乎相同，其他9 个ORF 除了ORF9 和ORF10以外，PCV2 都比PCV1 小，PCV1 在ORF1、ORF2、ORF4、ORF5、ORF6和ORF10 编码的蛋白中含有糖基化位点，而PCV2 仅在ORF1、ORF4 中含有糖基化位点。ORFl 和ORF2 为主要阅读框，ORFl 编码与病毒复制相关的Rep 蛋白，而ORF2 编码病毒的主要结构蛋白，即病毒核衣壳蛋白（Cap），研究表明Cap 蛋白与PCV2 的免疫保护性有关。ORF1 变异较小，而ORF2变异较大。最近第3 个病毒基因ORF3被确定，ORF3 蛋白是一个高度保守的蛋白，在PCV2 各分离株之间氨基酸同源性达到95% 以上。其余的比较小的ORFs 的功能尚不明确。 猪是PCV2 的天然宿主，各种年龄、不同性别的猪都可感染病毒，但以哺乳期和育成期的猪最易感，尤其是5 ～ 12周龄的仔猪，一般于断奶后2 ～ 3 d 开始发病，急性发病猪群中，病死率可达10%，在疾病流行感染过的猪群中，发病率和死亡率都较低，如果并发或继发细菌或病毒感染可使死亡率大大增加。加拿大是首次报道PMWS 的国家，但时至今日，多数农场的猪群中仍然只是散发，很少呈流行性发生PMWS，但是与PCV2 有关的PNDS、心肌炎和繁殖障碍综合征等疾病正引起了人们更多的关注。在美国，PCV2 感染和猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流感病毒引起的疾病相比较轻，发病慢而缓和，人们对PCV2 是否引起呼吸道疾病综合征(PRDC) 这一问题仍存在异议。PCV2 感染10 ～ 12 周龄肥育猪，死亡率10% ～ 15%，淘汰率5% ～ 10%，哺乳猪死亡率不足2%。此外英国、法国、德国、意大利、北爱尔兰、西班牙、新西兰、墨西哥、阿根廷丹麦、韩国、日本等均有本病的发生和报道。血清学调查表明，PCV2 感染广泛，多数猪群血清阳性率为20% ～ 50%。在北美和欧洲猪群中，发病率占被侵袭猪群的5% ～ 10%，发病死亡率达100%，德国屠宰猪血清中抗体阳性率达85%，英国随机采集的猪血清样品中血清阳性率达80%。比利时对1985—1999 年不同类型猪血清样品检测表明，PCV2 阳性率达100%，郎洪武等应用ELISA 法对我国7 省市不同类型猪群559 份样品进行检测，总阳性率达42.9%，表明PCV2感染在我国猪群中普遍存在。我国猪群中PCV2 感染情况也不容乐观。我国对PCV2 的研究始于1999 年底，有学者对我国部分猪群的流行病学调查发现猪群中广泛存在PCV2 抗体。 5.1 灭活疫苗 采用人工培养大量繁殖免疫原性好的病原微生物，灭活、浓缩后按一定比例加入佐剂制成的疫苗，称为灭活疫苗，该疫苗可由病原微生物的完整个体组成，也可由其某些片段组成。灭活疫苗具有无毒、无害、效果稳定的优势。国内外对猪圆环病毒灭活疫苗的研究已取得了巨大进展。法国梅利亚公司研究、开发的PCV2 油包水乳剂灭活疫苗，在欧洲一些国家已注册上市，免疫后备母猪经产母猪，仔猪可通母源抗体获得保护，实验和临床证明，该疫苗有较好的效果，可减少感染、排毒，减轻临床症状。国内现有3 种自主研发的猪圆环病毒常规灭活疫苗获准生产上市，其中PCV2 灭活疫苗LG 株由哈尔滨兽医研究所研制，该产品免疫应答快，效果好。另有南京农业大学研发的PCV2 灭活疫苗SH 株和北京大北农集团研制的PCV2 灭活疫苗DBN-SX07 株。 5.2 弱毒疫苗 采用抗原性好的无毒株、天然弱毒株或人工诱变的弱毒株制成的疫苗称为弱毒疫苗，该类疫苗具有不少优点如接种数量少，可刺激机体产生细胞免疫、体液免疫和黏膜免疫，免疫效果好等，但也存在一些缺点如可能会发生毒力返强，储存和运输需在冷冻条件下，易失活，易被细菌污染等。Fenaux 等将PCV2 于PK-15 细胞上传120 代， 结果120 代病毒比初代病毒滴度高出一个log 单位，同时，传30 代后Cap 基因110 位脯氨酸变为丙氨酸(P110A) 并维持到120 代，此外191 位精氨酸变为丝氨酸(R191S)，突变毒株在猪体内的接种实验表明，PCV2120 代病毒血症时间和猪血清病毒含量明显低于第1 代，即PCV2120 代明显致弱。也有人将PCV2 的ORF2 克隆到缺失ORF2 的PCV1 的骨架中，得到PCV1-2 嵌合型病毒。研究表明，该嵌合型病毒是减毒的，能刺激机体产生特异性免疫反应，可作为制备PCV 弱毒疫苗的优势毒株，且具备不易发生毒力返强的优势。 5.3 亚单位疫苗 只含有病原微生物的抗菌抗原成分，而不含有核酸，但能刺激机体产生特应性免疫应答的一类疫苗，称为亚单位疫苗。付玉洁等为评价猪圆环病毒(PCV)2a/2b 两种基因型病毒株及其重组Cap 蛋白(rCap) 之间的交互免疫，采用重组杆状病毒表达的2 种Cap 蛋白(PCV2a-rCap 和PCV2b-rCap) 亚单位疫苗。免疫小鼠后进行攻毒，结果，以PCV2a 和PCV2b 各为指示病毒对病毒抗血清和rCap 蛋白抗血清进行交叉中和试验，同型病毒株与同型血清的中和抗体效价均高于异型病毒株。病理观察显示，免疫鼠均未见明显病理变化，攻毒对照鼠肺脏出现一定程度的病理损伤。刘丹等以重组杆状病毒表达的重组PCV2-Cap 蛋白制备亚单位疫苗，免疫BALB/c 鼠测定其抗体、中和抗体。结果表明，该蛋白亚单位疫苗能够提供良好的免疫保护效果，能够有效诱导小鼠产生明显的体液免疫应答。 5.4 核酸疫苗 构建含有外源抗原基因的重组质粒，免疫动物后，表达的特异性抗原蛋白通过与MHC- Ⅰ 类或MHC- Ⅱ 类抗原分子结合，刺激机体产生特异性免疫应答，该类疫苗称为核酸疫苗，又名DNA 疫苗。Kamstrup 等为了进一步探索衣壳蛋白免疫预防的适用性，采用了pcDNA3.1/V5-His-TOPO 真核表达载体克隆了PCV2 的ORF2 基因，并证实了此质粒能够在体外( 通过直接表达蛋白) 以及体内( 通过对小鼠用基因枪注射质粒，诱导小鼠免疫产生抗体)进行表达。免疫试验结果表明，所构建的核酸疫苗均能诱导小鼠产生一定的体液免疫和细胞免疫反应。Aravindaram等用构建的含PCV2 ORFl、ORF2、ORF3 的3 种重组质粒单独或联合免疫小鼠，2 周后加强免疫，结果发现ORF2/3 与ORFl/2/3 这2 种质粒组合免疫后PCV2 病毒载量显著减少，诱导产生的IFN-γ、TNF-α、GM-CSF以及PCV2 抗体水平均高于其他免疫组，小鼠的肺部病变也明显减轻。史小红等将重组真核表达质粒pcDNAORF1-ORF2 免疫小鼠，2 周后加强免疫， 同时设置pcDNA-ORF1、p c D N A - O R F 2 、p c D N A 3 . 1 - ( + ) 、PCV2 全毒疫苗和PBS 对照。结果表明，该重组质粒诱导产生PCV2 抗体水平与其他试验组相比差异显著。闫若潜等[15]将猪圆环病毒2 型（PCV2）ORF2/ 猪白介素-2(PoIL-2) 嵌合重组表达质粒(rpcDNA3.1/PCV2-1inker-PoIL-2) 免疫10 日龄健康仔猪，结果发现重组质粒对猪体的免疫和免疫保护效果显著。 5.5 活载体疫苗 采用弱毒或无毒病原微生物作为表达载体，对其导入外源抗原基因，制成疫苗后，接种动物，诱导机休产生特异性免疫应答反应，这类新型疫苗称为活载体疫苗。Wang 等将PCV2 ORF2克隆入E.coli/L.lac 分泌型穿梭表达载体pSEC:LEISS，构建了重组穿梭载体pSEC:LEISS-dCap，电转化乳酸菌NZ9000，获得能有效表达Cap 蛋白的重组乳酸杆菌，将该菌培养液经口灌喂对Balb/c 小鼠的生长发育没有影响，无毒性作用，能够诱发小鼠产生抗Cap蛋白的特异性IgG 抗体，刺激肠道黏膜淋巴组织对其产生黏膜免疫。Pei 等在PRRSV cDNA 克隆的ORFs1b 与2a插入2 个限制性酶切位点及1 个转录调节序列，将其改造成一个病毒载体，然后将PCV2ORF2 基因插入2 个限制性酶切位点间，由插入的转录调节序列启动转录，转染Marc-145 细胞获得了P129-PCV 重组PRRSV，2 次免疫仔猪，首免后3 周内，母源抗体存在，抗体水平不断下降，而二免后1 周，免疫猪产生了PCV2 特异性的抗体应答，结果表明PRRSV 能成功表达猪其他病原的免疫原性蛋白，并诱发特异性的免疫反应，可以作为表达外来病原的猪疫苗载体。宫婷等构建了表达猪圆环病毒2 型Cap 蛋白重组复制缺陷型人5型腺病毒，对重组腺病毒的分子生物学鉴定和在小鼠上的初步免疫试验结果表明，重组腺病毒可介导Cap 蛋白在真核细胞中的表达，并且表达的靶蛋白具有较好的免疫原性，为进一步将其开发成新型PCV2 疫苗奠定了基础。王子龙等利用NDV LaSota 弱毒疫苗株为活病毒载体，通过反向遗传操作系统构建出表达PCV2Cap 的重组病毒(rLa-PCV2/Cap)，以及表达删除核定位信号(NLS) 的Cap(CapΔ41) 的重组病毒(rLa-PCV2/CapΔ41)，并对外源蛋白的表达效果进行了检测，为研究新型PCV2 疫苗奠定基础。钞安军等将PCV2 ORF2 基因插入到PRV 通用载体pG 中，成功构建了重组病毒PGO，并用该重组病毒免疫6 周龄雄性小鼠并检测分析了PGO 的免疫原性，结果表明，该重组病毒能有效抵抗PCV2 强毒攻击。 |
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