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Eyeview 2011/12 Regeneron生物制药公司研发的一种抗血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF）的眼科新药---VEGF Trap-Eye, 经快速通道报请美国国家食品药物管理局（FDA）审查，2011年6月，由美国各科医师组成的FDA的专家评审委员会审查讨论后，全票一致地向FDA推荐：应批准这一新的抗-VEGF的眼内注射药用于新生血管性年龄相关性黄斑变性(wet AMD) 的治疗。2011年11月18日美国FDA批准了这第三个抗血管内皮生长因子的眼科新药：VEGF Trap-Eye (药名：aflibercept; 商品名：Eylea艾力亚) 。它的批准与第一个抗-VEGF眼科药物Macugen相隔７年和第二个抗-VEGF眼科药物Ranibizumab (Lucentis, 兰尼单抗）相隔5年。VEGF Trap-Eye具有怎样的优势得到美国FDA批准，成为第三个抗血管内皮生长因子的眼科药物呢？ Regeneron的科学家发明和建立了细胞因子捕获剂（Cytokines Traps）的技术之后，针对抑制肿瘤的新生血管，设计了血管内皮生长因子捕获剂（VEGF Trap）。在进行肿瘤动物实验的同时，组建了眼科研究小组，探索VEGF Trap用于眼部新生血管疾病的治疗, 历经数年，不仅严谨地完成大量的眼科疾病的动物实验，成功证明其有效地抑制视网膜新生血管的药效和药物动力学，而且优化了眼内注射溶剂，解决了使用剂量和药效持续时间等问题，成就VEGF Trap-Eye新药并开拓了它在眼科的应用前景。VEGF Trap-Eye 是FDA批准的唯一的每两个月注射一次治疗wet AMD的抗-VEGF的玻璃体内注射制剂，明显优于其他抗血管内皮生长因子的眼科药物。作者基于已发表的有关VEGF Trap-Eye的动物实验和临床试验的文献，国际和美国眼科会议的报告，以及Regeneron 生物制药公司网站公布的资料，撰写此文献综述，将VEGF Trap-Eye的设计理念, 药物结构特点，动物实验和临床试验等方面作一介绍。 VEGF Trap-Eye的设计理念： 上个世纪后期，随着对血管内皮生长因子的作用机制的进一步阐明，与它们结合引导其信号传递的多种特异性受体的不断发现，以及深入理解受体不同的活性区域的特征，我们对血管内皮生长因子在人类疾病的发生发展中的作用已有相当的了解，大量的资料表明，细胞因子和生长因子对多种主要的生物过程有重大的影响，对人类疾病的发生发展也起关键作用，已被证明是最好的治疗目标之一。体内外试验均证实VEGF是很合适的药物靶目标,特别是用于癌症和与新生血管相关的眼科疾病。近十几年来，单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAbs）生产技术的不断改进，由鼠源单抗，鼠人混合单抗，发展到部分人源或全人源单抗的制备，单克隆抗体在生物制药业成为了新一类迅速发展的治疗药物1。具有治疗作用的单克隆抗体的机制还不完全清楚, 但针对细胞因子或生长因子的抗体可以抑制细胞因子或生长因子的活性。采用单克隆抗体技术，将细胞因子作为靶目标，代表着抗细胞因子药物开发的新选择。但是，单克隆抗体药物因免疫反应，如急性过敏，血清病和产生抗体等副作用，使其在临床应用上面临挑战2。 细胞因子与其特定细胞表面的受体的结合而产生细胞生物效应。细胞因子的受体多为复合的“多元化的受体系统 (multiple-component receptor system)”。这种复合的“多元化的受体系统“的特点，通常是，细胞因子和低亲和力第一受体结合后方可和第二个受体结合，形成配体和受体的复合体。实验证明由两种不同的受体组成的复合体明显地提高了与配体的亲和力，从而具有潜在的治疗用途。综合当时最新研究资料和趋势，Regeneron生物制药公司的药物研发小组提出构想：如果我们构建一种可溶性受体，采用“多元化的受体系统“的两个不同的受体成分作为特异性捕获分子，就可以提高与其配体（即细胞因子或生长因子）的亲和力，产生一种具有潜在治疗用途的强大威力的抑制剂。在这样的构想下，经过反复实验，终于一种称为“细胞因子捕获剂（Cytokine traps）” 的融合蛋白的框架构建成功3。这种细胞因子捕获剂的框架由IgG的恒定区域（Fc片断）与两个明显不同的可特异性与细胞因子结合的受体部分组成。它较单克隆抗体的优势是，通过模子化的框架更方便来定制受体捕获蛋白，既可延长其蛋白的稳定性和半衰期，还能选择性定位细胞和组织，甚至可施加毒理效应4。体内外实验证明细胞因子捕获剂可以强力阻抑细胞因子与细胞表面特异的受体结合，在对特定的细胞因子引发的疾病的控制和治疗，有明显的优势3。 血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor , VEGF）在正常的和病理性的血管生长中起关键作用，抑制肿瘤的新生血管可达到抑制肿瘤的生长。早期实验提示最有效的抑制VEGF信号的途径之一是通过注射可溶性的捕获受体来阻断VEGF 与其正常的受体结合5。由此，Regeneron 生物制药公司以血管内皮生长因子（VEGF）为靶点，设计血管内皮生长因子的捕获剂。他们从血管内皮生长因子受体1（VEGFR1）和受体2（VEGFR２）的活性功能区中筛选血管内皮生长因子受体的最佳组合，经过反复结合实验和药动力学实验，确定了高亲合力和最佳结合效果的受体区域，构建了一种稳定型?可溶性的?人Fc融合诱捕受体蛋白，命名为血管内皮生长因子捕获剂（VEGF Trap）5。其分子结构呈一个“Ｙ”字型的结构。“Ｙ”字型的两臂为功能特异性结合位点，分别取自人的血管内皮生长因子受体1（VEGFR1）的第２活性区域，和受体2（VEGFR２）的第３活性区域，两个活性区域接合成一个高亲和力的蛋白分子片断；将相同的两个蛋白分子片断连接在一起形成“Ｙ”字型的双臂形式（图1的上图）；第二部分是取自人的免疫球蛋白G1 ( IgG1)的Fc片断（图1的下图），它有提高蛋白的稳定性，延长药物半衰期的作用，还可增加药物的运送能力。Fc片断和上述的双臂蛋白分子连接，形成了一个完整的”Ｙ“字形状的新蛋白5。它的设计成功还体现在参照人体细胞因子和其受体的结合方式，构建出具有高亲和力，高特异性，和高捕获能力的新的一类抗血管内皮生长因子的药物。因子和受体结合实验显示VEGF Trap与血管内皮生长因子的亲和力高于其受体与配体的自然亲和力, 是Avastin 和Lucentis的300倍6. 7。动力学分析，VEGF Trap（~110 kDa）按1:1的比例与VEGF165（~40 kDa）结合形成复合体，分子量约150 kDa, 血循环内的含量稳定达30天; 而抗血管内皮生长因子的单克隆抗体药物Avastin则形成异质的多种成分的免疫复合物,分子量在300-2000 kDa之间，后者可快速沉积在组织中，在血循环中的含量迅速减少8。肿瘤的体内外研究证实了VEGF Trap是一种新的强力的可完全阻抑血管内皮生长因子活性的药物9-10。 VEGF Trap-Eye的功能特点 虽然VEGF Trap的最初设计是针对肿瘤的新生血管， 但对VEGF Trap用于眼部新生血管病变的探索促成了VEGF Trap-Eye新药，开拓了VEGF Trap-Eye的眼科应用11。抗-VEGF眼科治疗有三个主要证据12: (1) 病人眼内VEGF水平升高与眼新生血管的存在的相关性，已有报道玻璃体内VEGF水平升高见于多种新生血管性眼病，包括新生血管性 (湿性) AMD 13, 中央视网膜静脉阻塞14, 糖尿病黄斑水肿 (DME) 和糖尿病视网膜病变 (DR) 15,16, 早产儿视网膜病变17, 虹膜新生血管（虹膜红变）和新生血管性青光眼17； (2) 动物实验显示实验性VEGF水平升高导致眼新生血管发生; (3) 反向实验，即抑制VEGF的表达或阻止信号的传递就可抑制新生血管的形成。VEGF Trap-Eye分子量约为115KDa，有以下特点: (1) VEGF Trap翻译为血管内皮生长因子捕获剂，顾名思义它的作用是捕捉游离的血管内皮生长因子，但实际功能不限于此。据血管内皮生长因子和多受体的信号网络，已证明VEGF Trap可与血管内皮生长因子Ａ（ VEGF－Ａ）的全部亚型(VEGF-A121，VEGF-A145，VEGF-A165，VEGF-A189和VEGF-A206)结合，还可与胎盘生长因子(placenta growth factor, PIGF) 结合5, 11； (2) 全部是人的氨基酸序列; (3) 可穿过视网膜全层； (4) VEGF Trap-Eye 经特别纯化，专为眼科玻璃体注射所制备，避免对眼组织的刺激，减轻玻璃体内注射反应。  图1，显示VEGF Trap-Eye 的人融合蛋白的结构组成。上图显示VEGF的受体1 （VEGFR1）和受体2（VEGFR2）的功能区（左上图），构成具有特异性结合功能的片断（中上图）， 两个相同的片断形成双臂的形式（右上图）。下图显示人的IgG免疫球蛋白的Fc片断（左下图）和VEGF的受体1和受体2（中下图）连接形成VEGF Trap-Eye蛋白的“Y”形结构（右下图）。 将VEGF Trap-Eye注射到玻璃体后，它可捕捉眼玻璃体内游离的血管内皮生长因子；另外，它还可以穿透视网膜和其他眼组织，捕捉组织内的血管内皮生长因子，从而完全阻断血管内皮生长因子信号传递，达到较长时间的抑制新生血管生长的作用。表一列出美国FDA批准的三种抗 血管内皮生长因子的眼内注射药物的特点。  VEGF Trap-Eye的临床前期动物实验（Preclinical experiments） 从2000年始，Regeneron的眼科研究小组，创建多种动物模型来检测VEGF Trap-Eye药物的疗效，剂量，给药时间，以及安全性等问题。历经数年的大量眼科疾病的动物实验，验证了VEGF Trap-Eye对新生血管性眼病治疗有广泛的临床应用价值，包括以下几个方面: (1) 小鼠角膜新生血管和角膜移植的模型显示VEGF Trap-Eye, 经静脉，玻璃体和局部给药, 均抑制角膜新生血管生长18-21 和伴随的淋巴管的生长22, 23; (2) 在视网膜下注射Matrigel造成的大鼠脉络膜新生血管（choroidal neovascularization, CNV）的模型中，VEGF Trap-Eye可以减少因新生血管生长造成的视网膜损伤，预防炎症细胞的侵润和纤维的增殖 24 , 25; 在猴眼激光损伤造成的脉络膜新生血管模型，显示VEGF Trap-Eye可明显阻止CNV的发展和抑制活动性CNV渗漏26，27 。在胎盘生长因子（PIGF）基因敲除小鼠模型28，发现Matrigel注射引致的CNV 病变，由于PIGF基因功能缺陷而减轻，提示VEGF Trap-Eye可通过阻止胎盘生长因子的信号转递而治疗伴有CNV的视网膜病变；(3) 在狗和小鼠氧介导的视网膜病变模型，揭示VEGF受体2（VEGFR2）29和PIGF 30 参与氧介导视网膜新生血管生长的发生和发展，VEGF Trap-Eye可 抑制由缺氧引起的新生血管的生长，但对正常发育的视网膜血管无抑制作用31, 32 ; (4) 大鼠糖尿病视网膜病变模型, VEGF Trap-Eye可显著降低视网膜血管的渗漏，减少视网膜血管内白细胞的黏附，有助于糖尿病视网膜病变的改善33，34。 2004年2月，Avastin得到FDA 批准用于肿瘤治疗； 2004年12月，FDA第一次批准抗-VEGF的玻璃体内注射药物Macugen用于治疗Wet AMD。2005年6月，Rosenfeld医师和其同事发表了他们off-label使用Avastin，分装后玻璃体注射治疗Wet AMD和中央视网膜静脉阻塞的结果35, 36。Avastin眼内注射可抑制新生血管生长，减轻黄斑水肿，使视网膜的厚度减薄，明显优于Macugen。Avastin off-label用于Wet AMD的治疗结果揭开了眼科抗-VEFG治疗的序幕，是眼科界乃至整个医疗领域的一项重大突破。2006年FDA 批准了抗-VEGF治疗wet AMD的第二个药物Lucentis,它的临床试验结果令人振奋37，治疗后视力明显提高，是抗-VEGF治疗wet AMD的里程碑。这些结果使VEGF Trap-Eye的研发充满希望， 同时又面临强大的挑战。Regeneron生物制药公司加快转化研究成果，VEGF Trap-Eye进入下一个关键的临床试验阶段。 VEGF Trap-Eye的临床试验（Clinical trials） 据美国临床试验机构的登记和统计，从2005年截至到2011年12月，使用VEGF
Trap和VEGF Trap-Eye剂型，与眼科疾病相关的临床I-III试验有16项（www.Clinical Trials.gov），包括新生血管性年龄相关性黄斑变性，中央视网膜静脉阻塞，糖尿病黄斑水肿和病理性高度近视性脉络膜新生血管（表二），以及眼脉络膜肿瘤等。正在进行和已完成的临床II或III期试验由多个国家的医疗单位承担，随机分组，双盲试验,为期24-52周或2年；在治疗期间与现在临床应用的药物，仪器或空白组进行对比。根据2011年8月Boston举行的第29届美国视网膜专家学会 (American Society of Retina Specialists, ASRS) 上报道的VIEW1, VIEW2, DA VINCI, GALILEO 和COPERNICUS等临床试验结果（www.），作者对这些临床试验的主要结果作一简介。  VEGF Trap-Eye对新生血管性年龄相关性黄斑变性的治疗 经第I期临床试验CLEAR-IT 1 ( CLinical Evaluation of Anti-angiogenesis in the Retinal Intravitreal Trial)38和第II期临床试验CLEAR-IT 239, 40, 检测有效性和安全性之后，由Bayer和Regeneron联合开展，2007年8月同期开始了两个大样本VIEW 1 （Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Trap-Eye Investigation of Efficacy and Safety in Wet AMD) 和VIEW2的第III期临床试验，在2011年顺利完成。这两个III期临床试验以维持和提高视力为首要治疗目的（>0个字母），等于或大于15个字母为第二级治疗目标；试验设计主要目的之一是与Lucentis对比，在维持最佳治疗效果的基础上，检验VEGF Trap-Eye玻璃体注射剂量，次数，间隔时间和并发症（图2）。  图2，VIEW 1 和 VIEW 2的临床试验设计（左图）。在视力提高的两个分类中（> 0 和 >15 个字母），VEGF Trap-Eye与 Lucenti所观察到的病人百分比相似 （右图）。 VIEW1 & VIEW2共约2457例病人参与,是迄今为止病人数量最多的临床试验。两个研究的第一年的结果非常一致，显示在抑制异常血管生长，消除血管渗漏，减轻视网膜水肿等临床体症，延缓或阻止疾病发展，提高视力等疗效方面，保守地说，VEGF Trap-Eye不低于Lucentis（兰尼单抗）（图2），达到了临床试验的首要和次级治疗目标（图3）。VEGF Trap-Eye优势在于，标准的前负荷治疗三个月后，可每两月注射一次（2q8组）；而Lucentis必须每个月注射一次，减少注射次数或执行“需要时注射”的治疗不能有效地维持已获得的最佳治疗结果37。  图3，VIEW 1 和 VIEW 2的临床试验结果。VEGF Trap-Eye三个治疗组(0.5q4, 2q4, 2q8)，在1年治疗期间，视力（左图）和视网膜厚度（右图）的改善程度与 Lucenti组（Rq4）一致。 从已发表的pegaptanib 的VISION临床试验资料41，延长治疗时间（两年）有益于病人获得最好的机会保持视力，新生血管性年龄相关性黄斑变性和其他视网膜新生血管疾病需要反复和长期治疗。但眼玻璃体内注射不是无危险性的操作，反复和多次注射存在着并发症的潜在危险。2011年8月发表在美国眼科学期刊的一项2年随访新生血管性老年相关性黄斑变性治疗方法的对比调查显示, 采用抗- VEGF药物（i.e. Avastin, Lucentis和Macugen）眼玻璃体内注射治疗的6154名病例和采用非眼玻璃体注射治疗的6154名病例，总体发生严重眼并发症的危险（102%）和单针注射并发症的发生几率（4%），抗- VEGF眼玻璃体注射组均高于对照组，有显著性差异（p<0.01）42。因此，新审批的抗-VEGF眼玻璃体注射药物的所面临的挑战：在保证药物的最佳疗效的基础上，眼内注射药物次数和降低相关眼并发症的风险。据12月5日发布的新闻，VEGF Trap-Eye临床III试验的2年治疗结果显示：（1） 2年的治疗期间，平均11.2次注射，与治疗前相比，病人视力提高7.6 字母；其中第二年仅需4.2 次注射；而Lucentis 获的7.9字母视力提高，需平均16.5次注射，第二年需4.7 次注射。在相同治疗时间和获得相似治疗效果的条件下，VEGF Trap-Eye比Lucentis减少5次（32%）玻璃体内注射，明显降低并发症的风险；减少病人的就诊次数以及其家庭的经济和责任负担，改进了这类眼病的医疗需要。（2）VEGF Trap-Eye2年治疗结果显示视力的持续改善。（3）2年治疗期间，需要加强治疗（最多注射次数）的病人数，VEGF Trap-Eye组少于Lucentis组（15.9% 比26.5%）。视网膜眼科医生和病人均认为VEGF Trap-Eye的注射次数减少是此药的巨大优势。 2011年11月28日，Bayer和Regeneron宣布在中国开展治疗Wet AMD的临床三期试验，名为SIGHT 临床试验 (VEGF Trap-Eye: Investigation of Efficacy and Safety in Chinese patients with wet AMD) 。试验设计随机按3：1比例分组，双盲, 为期1年进行VEGF Trap-Eye和光动力疗法 (PDT) 对比治疗300病人, 28周视力改善为治疗的初级结果，然后，全部病人（包括PDT治疗组的）给于VEGF Trap-Eye治疗至52周。这项试验将是在中国开展的最大的视网膜病治疗的临床试验，预计2014年中旬结束。 VEGF Trap-Eye对中央视网膜静脉阻塞的治疗 治疗中央视网膜静脉阻塞而致的黄斑水肿，VEGF Trap-Eye的两个III期临床试验COPERNICUS ( COntrolled Phase 3 Evaluation of Repeated Intravitreal Administration of VEGF Trap-Eye In Central Retinal Vein Occlusion: Utility and Safety )和GALILEO研究在2009年同时进行。本文主要对COPERNICUS的半年的治疗结果做一介绍。 COPERNICUS研究共收入189个病人，按3：2的比列分组，纳入的病人中心视网膜厚度大于或等于250微米（图4）。VEGF Trap-Eye治疗组（2毫克注射剂量，每4周一次）和治疗空白对照组对比，24周的治疗结果见（图5）。VEGF Trap-Eye治疗组， 56.1%的病人获得大于15字母的视力改善，视力提高17.3字母；空白对照组视力下降-4.0字母；二者相比可见21.3字母的差异，有非常显著的统计学意义（p<0.001）。VEGF Trap-Eye治疗组，中心视网膜厚度明显下降达平均457.8微米， 对照组下降为144.8微米（图5），二者相差312.2毫米，有非常显著的统计学意义（p<0.001）。此外，VEGF Trap-Eye治疗组还明显降低了眼前节新生血管的发生。  图4，COPERNICUS临床试验研究设计。  图5，COPERNICUS临床试验研究6月治疗结果。VEGF Trap-Eye治疗后视力明显提高（左图）和中心视网膜厚度明显减薄（右图）。 VEGF Trap-Eye对糖尿病黄斑水肿的治疗 继一次注射VEGF Trap-Eye治疗糖尿病黄斑水肿眼病 43之后，第II期临床试验（DA VINCI）研究44(DME And VEGF Trap-EYE: INvestigation of Clinical Impact) 纳入220例糖尿病黄斑水肿患者，按1：1：1：1：1的比例随机分到5个治疗组（4个VEGF Trap-Eye不同剂量和间隔的治疗组和激光治疗对照组）；在治疗24 周和52周时检查视力 (visual acuity) 和中心视网膜厚度（central retinal thickness）两个指标（图6）。与激光治疗组对比，VEGF Trap-Eye各组的视力均显著提高, 中心视网膜厚度明显下降（图7）。VEGF Trap-Eye的4个治疗组，均在第一次治疗（4周）后，视力大幅提高。52周时，视力提高9.7-13.1个字母, 显著好于激光治疗组,后者下降1.3个字母（左图）。VEGF Trap-Eye治疗可使中心视网膜厚度明显减薄。第一次治疗4周后OCT测定，中心视网膜厚度减薄100-150微米；52周时达165.4到227.4微米不等。而激光治疗组，中心视网膜厚度只减54微米，具有非常显著的统计学差异（p<0.0001）。VEGF Trap-Eye玻璃体注射的并发症为1-2%，常见为眼内炎，脉络膜炎和闭角青光眼；激光治疗的并发症为1-3%，多为糖尿病视网膜水肿，视力降低和玻璃体出血。  图6，DA VINCI 研究设计了4个不同剂量和间隔时间的VEGF
Trap-Eye治疗组，和局部激光治疗对照组。  图7，DA VINCI临床试验研究VEGF Trap-Eye治疗糖尿病黄斑水肿的结果，表现在视力改善（左图）和中心视网膜厚度减薄（右图）两个指标。 小结：本综述对VEGF Trap-Eye (Eylea，艾力亚) 早期药物开发? 药物设计和结构特点，动物实验和临床试验等方面作了介绍。在严密的，严格的和严谨的临床前期动物实验的科研基础上，将VEGF Trap-Eye药物开发研究成果成功地转化为临床应用。VEGF Trap-Eye是FDA批准的唯一的每两个月注射一次治疗wet AMD的抗-VEGF的玻璃体内注射制剂；目前完成的多项临床II/III期试验的结果显示，VEGF Trap-Eye具有明显和独特优势，在不远的未来，将扩展到治疗中央视网膜静脉阻塞，糖尿病黄斑水肿等其他致盲的新生血管性视网膜疾病。 参考文献 1. Kaur et al, Monoclonal antibodies: Pharmacological relevance, Indian J Pharmacol. 2007 2. Hansel et al, the safety and side effects of monoclonal antibodies. Nature Review 2010 3. Economides et al, Cytokine traps: multi-component, high-affinity blockers of cytokine action. Nat Medicine 2003; 9(1):47-52 4. Schmidt SR, Fusion-proteins as biopharmaceuticals ---applications and challenges. Curr Opin Drug Discov Devel 2009; 12 (2) : 284-95 5. Holash et al., VEGF-Trap: A VEGF blocker with potent antitumor effects. Proc Natl Acad Sci USA. 2002; 99(17):11393-11398 6. 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