一种高密度培养多粘类芽孢杆菌的方法

专利名称一种高密度培养多粘类芽孢杆菌的方法
技术领域本发明属于微生物发酵领域，更具体涉及一种高密度培养多粘类芽孢杆菌 {Paenibacillus polymyxa )的方法。
背景技术多粘类芽孢杆菌QPaenibacUIus polymyxa)是一种产芽孢的G+细菌，对人或动植物没有致病性，可产生多肽抗生素、拮抗蛋白、酶、植物激素、絮凝剂等多种生物活性物质， 兼有生物农药和生物菌肥的作用，已广泛应用于农业、工矿业及废水处理等领域。美国环境保护署(EPA)已将其列为可在商业上应用的微生物种类之一，我国农业部也将其列为免做安全鉴定的一级菌种。多粘类芽孢杆菌是一种植物根际促生细菌，一方面可以用作微生物肥料，促进植物生长、提高作物产量；另一方面，可以有效防治植物细菌性和真菌性土传病害，对植物青枯病、番茄枯萎病、油菜腐烂病、黑松根腐病等多种植物病害具有很好的防治效果。传统农业中化学农药的过量使用不仅会增加农药残留量，同时导致了许多作物病虫害的抗药性，并对土壤、水体及生态环境造成污染。随着社会的进步，人们生活水平的提高，对食品安全的意识不断加强，在这种情况下应用高效、广谱、安全、无毒的有益微生物进行植物疫病的防治越来越受到人们的重视。多粘类芽孢杆菌产生的多肽类抗菌物质对植物病原真菌具有很好的拮抗活性，且性质比较稳定，可用于多种植物病害的生物防治。因此， 多粘类芽孢杆菌是一类极具开发前景和应用价值的生防细菌。目前国内对多粘类芽孢杆菌的研究主要集中在菌种的筛选、分离鉴定、抑菌效果以及对发酵液化学成分的分析，而对于多粘类芽孢杆菌的发酵培养方面还罕见报道。
发明内容
本发明提供了一种高密度培养多粘类芽孢杆菌的方法，以提高多粘类芽孢杆菌的
菌体产量。本发明提供的高密度培养多粘类芽孢杆菌的方法，具体如下以多粘类芽孢杆菌 (.Paenibacillus polymyxa)为菌种，经活化后接种到发酵培养基中培养。发酵培养基为可溶性淀粉15-20g/L、蛋白胨20-25 g/L, NaCl 0.5-1.25 g/L、 Na2HPO4 0. 2-0. 5 g/L、CaCl2 0. 5-1. Og/L, ρΗ7· 0-8. 0 ；培养条件培养温度 30_33°C、转速 170-200r/min、装液量 60-80mL/250mL ；接种量为 10-15% (v/v)，培养时间 18_20h。
更优选地，可溶性淀粉 17.5 g/L、蛋白胨 25.0 g/L、NaCl 1.25 g/L、Na2HPO4 0.5 g/ LXaCl2 1. 0 g/L，pH7. 5 ；培养条件培养温度 30°C、转速 170r/min、装液量 80mL/250mL ；接种量为10% (v/v)，培养时间18h。所述活化采用牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂 15g-20g，蒸馏水 IOOOmL, pH7. 0-7. 2，37°C活化 24h。
经过以上条件优化，多粘类芽孢杆菌的细胞生物量可达5. 3X109cfu/mL,比优化前
3(3. 17X108cfu/mL)提高了 15. 72 倍。本发明的显著优点多粘类芽孢杆菌是一种非常具有应用潜力的生物农药和微生物肥料，但要实现商业化，还必须加强培养基及培养条件优化等方面的研究。本发明通过对培养基配方及培养条件的研究，为多粘类芽孢杆菌的工业化发酵生产以及进一步开发利用打下基础。
附图说明

图1为多粘类芽孢杆菌的生长曲线；
图2为不同碳源对多粘类芽孢杆菌生长的影响； 图3为可溶性淀粉添加量对多粘类芽孢杆菌生长的影响； 图4为不同氮源对多粘类芽孢杆菌生长的影响； 图5为蛋白胨添加量对多粘类芽孢杆菌生长的影响； 图6为不同无机盐种类对多粘类芽孢杆菌生长的影响； 图7为培养基初始PH值对多粘类芽孢杆菌生长的影响； 图8为培养温度对多粘类芽孢杆菌生长的影响； 图9为转速对多粘类芽孢杆菌生长的影响； 图10为培养基装液量对多粘类芽孢杆菌生长的影响； 图11为接种量对多粘类芽孢杆菌生长的影响。
具体实施例方式以下实施例采用的多粘类芽孢杆菌为多粘类芽孢杆菌S-7 (参考文献史应武等， 内生多粘类芽孢杆菌S-7对甜菜光合作用及产量和品质的影响.应用生态学报，2009，20 (3) =597-602.)，进一步描述本发明，但是本发明不仅限于此。实施例1
1.多粘类芽孢杆菌生长曲线的测定
将多粘类芽孢杆菌活化后，以5% (ν/ν)的接种量接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水lOOOmL，pH7. 0-7. 2)中，装液量100mL/250mL， 在30°C、200r/min下培养，分别采用分光光度法和平板菌落计数法测定不同培养时间时的 OD600值和菌落数，以培养时间为横坐标、分别以OD6tltl值和菌落数为纵坐标绘制生长曲线图 (图1)。由生长曲线确定多粘类芽孢杆菌的最佳培养时间为18h。2.多粘类芽孢杆菌的培养基配方优化
以牛肉膏蛋白胨液体培养基为基础培养基，研究不同碳源、氮源、无机盐对多粘类芽孢杆菌细胞生物量的影响。培养条件接种量5% (v/v)，装液量100mL/250mL，在30°C、200r/ min下培养18h。2.1碳源种类对多粘类芽孢杆菌细胞生物量的影响
分别以1%(表示g/100mL，以下类同)的蔗糖、环糊精、麦芽糖、可溶性淀粉、乙酸钠、葡萄糖为碳源，取代牛肉膏蛋白胨液体培养基中的牛肉膏，考察它们对多粘类芽孢杆菌细胞生物量的影响，以碳源种类为横坐标，0D_增长量为纵坐标作图。图2显示，以可溶性淀粉为碳源时，多粘类芽孢杆菌的0D_增长量最大，为1. 184 ；而用乙酸钠和葡萄糖作为碳源时，0D600增长量较小。综合细胞生物量和培养基成本进行考虑，确定采用可溶性淀粉作为碳源。2.2碳源添加量对多粘类芽孢杆菌细胞生物量的影响
比较可溶性淀粉不同添加量对多粘类芽孢杆菌生长的影响，以碳源添加量为横坐标， 0D_增长量为纵坐标作图(图3)。结果表明，随着可溶性淀粉添加量的增加，0D_增长量也不断提高，当碳源添加量为1. 75%时，多粘类芽孢杆菌的0D_增长量达到最高，为0.982。 随之继续增加可溶性淀粉的添加量，OD6tltl增长量缓慢下降。因此，确定多粘类芽孢杆菌可溶性淀粉的最适添加量为1.75%。2.3氮源种类对多粘类芽孢杆菌细胞生物量的影响
在碳源优化的基础上，分别以1%的蛋白胨、磷酸二氢铵、氯化铵、硝酸铵、硫酸铵、硝酸钠为氮源，考察它们对多粘类芽孢杆菌细胞生物量的影响，以氮源种类为横坐标，OD600增长量为纵坐标作图(图4)。结果表明，多粘类芽孢杆菌利用蛋白胨作为氮源时，OD6tltl增长量最高，为0.942 ；而采用无机氮源时，细胞生物量相对较低，因此选取蛋白胨作为培养基的氮源。2.4氮源添加量对多粘类芽孢杆菌细胞生物量的影响
以蛋白胨添加量为横坐标，以OD6tltl增长量为纵坐标，将菌悬液稀释10倍后测定0D_ (图5)。结果表明，随着蛋白胨添加量的增加，OD6tltl增长量也随之提高；当蛋白胨添加量为 2. 5%时，多粘类芽孢杆菌的OD6tltl增长量达到最高，为0. 679 ；随后继续增加蛋白胨的添加量，OD600增长量有所下降。因此，确定枯多粘类芽孢杆菌的蛋白胨添加量为2. 5%。2.5无机盐种类对多粘类芽孢杆菌细胞生物量的影响
在碳源、氮源优化的基础上，分别以0. 5%的磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钾、钼酸钠、 硫酸锰、硫酸镁、氯化钙、硫酸亚铁为无机盐添加到培养基中，以无机盐种类为横坐标，0D_ 增长量为纵坐标，将菌悬液稀释10倍后测定OD6tltl(图6)，确定最佳无机盐。结果表明，当以 NaCl、Na2HPO4和CaCl2作为无机盐时，多粘类芽孢杆菌的OD6tltl增长量较大，分别为1. 101、 0. 825,0. 748，因此选择NaCl、Na2HP04和CaCl2作为多粘类芽孢杆菌培养的最佳无机盐。在确定最佳无机盐种类的基础上，进一步深入研究无机盐的最适添加量及其相互作用。2. 6无机盐添加量对多粘类芽孢杆菌细胞生物量的影响
不同的微生物生长所需的无机盐种类和浓度不同。上述实验结果表明，NaCl, Na2HPO4 和CaCl2对多粘类芽孢杆菌生长的影响较为明显，因此以这三种盐为考察因素设计正交试验“(34)，对无机盐配方进行优化。通过单因素试验，初步确定上述无机盐的较优水平分别为 NaCl 0%-0. 25%, Na2HPO4 0%-0. 1%、CaCl2 0%-0. 1%。
表1多粘类芽孢杆菌无机盐优化正交试验因素和水平表
权利要求
1.一种高密度培养多粘类芽孢杆菌的方法，其特征在于以多粘类芽孢杆菌(.Paenibacillus polymyxa)为菌种，经活化后接种到发酵培养基中培养；发酵培养基为可溶性淀粉15-20g/L、蛋白胨20-25 g/L, NaCl 0.5-1.25 g/L、Na2HPO4 0. 2-0. 5 g/L、CaCl2 0. 5-1. Og/L, ρΗ7· 0-8. 0 ；培养条件培养温度 30_33°C、转速170-200r/min、装液量 60-80mL/250mL ；接种量为 10-15% (v/v)，培养时间 18_20h。
2.根据权利要求1所述的高密度培养多粘类芽孢杆菌的方法，其特征在于所述发酵培养基为可溶性淀粉17.5 g/L、蛋白胨25.0 g/L、NaCl 1.25 g/L,Na2HPO40. 5 g/L、CaCl2 1. 0 g/L, ρΗ7· 5。
3.根据权利要求1所述的高密度培养多粘类芽孢杆菌的方法，其特征在于所述培养条件为培养温度30°C、转速170r/min、装液量80mL/250mL ；接种量为10%( v/v)，培养时间18h。
4.根据权利要求1所述的高密度培养多粘类芽孢杆菌的方法，其特征在于所述活化采用牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15g-20g，蒸馏水IOOOmL, pH7. 0-7. 2，37°C 活化 24h。
全文摘要
本发明属于微生物发酵领域，更具体涉及一种高密度培养多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)的方法，以提高多粘类芽孢杆菌的菌体产量。该方法以多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)为菌种，经活化后接种到发酵培养基中培养。经过优化，多粘类芽孢杆菌的细胞生物量可达5.3×109cfu/mL，比优化前(3.17×108cfu/mL)提高了15.72倍。本发明通过对培养基配方及培养条件的研究，为多粘类芽孢杆菌的工业化发酵生产以及进一步开发利用打下基础。
文档编号C12R1/12GK102559564SQ201210056279
公开日2012年7月11日 申请日期2012年3月6日 优先权日2012年3月6日
发明者严芬, 叶秀云, 李仁宽, 杨捷, 林娟, 陈晓红 申请人:福州大学