抗菌剂和抗菌性组合物的制作方法

专利名称抗菌剂和抗菌性组合物的制作方法
技术领域本发明涉及含有赤竹提取物(ササエキス)的抗菌剂，更详细地说，涉及含有赤竹提取物的抗破伤风杆菌剂、抗真菌剂、抗病毒剂和抗菌性组合物。
背景技术 从很早就已知赤竹提取物具有抗菌性。例如，有关于对伤口感染的病原菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、大肠杆菌(Escherichia coli)的抗菌效果以及对作为胃溃疡病原菌幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的抗菌效果的报道。
但是，作为伤口感染的病原菌，成为破伤风、气性坏疽、各种化脓性感染的病因的有芽孢和无芽孢厌氧菌也是重要的存在，但对于这些厌氧菌的抗菌作用的研究则至今未见报道。
评价具有抗菌能力的物质时，弄清楚该物质对人体病原菌的作用和对皮肤、粘膜上的固有益生菌或条件致病菌的作用是极为重要的。
另外，已知乳杆菌(Lactobacillus spp.)是口腔内、消化道内、阴道内的固有细菌。众所周知固有细菌对机体的作用具有两面性。乳杆菌也可从包括血液在内的临床材料中分离得到，决不应过低估其致病原学意义，但由于其分离频率极低，因而被当做是在各解剖学部位有用性高的细菌种类。乳杆菌被认为是对人具有很高有用性的菌群，赤竹提取物对其具有何种程度的抗菌作用，这是极引人关注的一个问题，但迄今为止未见到详细的研究结果。
皮肤上皮脂腺内固有的疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)是厌氧性无芽孢厌氧菌，在中等到重症的寻常痤疮中，其与金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌(Staphylococus epidermidis)等一起作为寻常痤疮的加重因子为人所知。目前，至今一直使用抗菌药(红霉素、四环素、那氟沙星)的乳膏、洗液来治疗寻常痤疮，但长期使用这些药将在临床上出现葡萄球菌(staphilococus spp.)、疮疱丙酸杆菌的耐药性问题，目前全世界都在研讨其对策。尚未见关于赤竹提取物对疮疱丙酸杆菌的研究结果。
二路普雷沃氏菌(Prevotella bivia)、有色普雷沃氏菌(PigmentedPrevotella spp.)在健康女性的阴道内仅以低于检出下限的数量存在，但与生殖道支原体(Mycoplasma genitalium)(人型支原体(hommnis))、阴道加德纳氏菌(Gardmerella vaginalis)、以厌氧消化链球菌(Peptostreptococcus anaerobius)为中心的厌氧性革兰氏阳性球菌、卟啉单胞菌(Porphyromonas spp.)等一起都是属于在细菌性阴道病(BV)的状态下异常增加的细菌性阴道病(BV)相关微生物范畴的专性厌氧性革兰氏阴性杆菌，作为子宫、盆腔内感染的病原菌，也是极为重要的细菌。所述细菌性阴道病(BV)的症状特征在于阴道内乳酸菌减少、阴道内pH低、以及具有乳样恶臭(胺臭)的白带。
虽然知道赤竹提取物具有抗菌作用，但至今未见关于其对上述BV相关细菌群菌种的抗菌作用的研究。
因此，通常不知道赤竹提取物是否对所有细菌都具有有效的抗菌活性，也不知道对细菌具有抗菌活性的天然提取物是否对念珠菌等真菌具有抗菌活性。
另一方面，破伤风是破伤风杆菌感染伤口部位，在该部位产生的神经毒素主要引起肌肉痉挛、僵硬、腱反射亢进的致命率很高的毒素性疾病。破伤风杆菌是可在土壤、人和动物的粪便中检测到的厌氧性杆菌，通过类毒素进行的自动免疫、通过抗毒素血清进行的被动免疫可有效预防治疗破伤风。但赤竹提取物对破伤风杆菌具有抗菌活性，这尚不为人所知。
病毒是不能自身增殖，而寄生于动植物、微生物上进行增殖的极微小的病原体，可分为动物病毒、植物病毒、微生物病毒。已开发出了各种用于预防治疗病毒性疾病的抗病毒剂，但仍需要无副作用的具有有效抗病毒活性的药物。
已知各种植物中所含的单宁酸具有抗菌作用。例如，虽然知道从赤竹以外的植物中得到的单宁酸对MRSA(甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌)具有抗菌作用，但因其副作用大，所以存在不能作为抗菌剂使用的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供抗菌剂，更具体地说，是提供抗破伤风杆菌剂、抗真菌剂和抗病毒剂。
本发明的其它目的是提供抗菌性组合物。
本发明提供含有赤竹提取物的下述抗菌剂、抗菌性组合物。
1.含有赤竹提取物的抗破伤风杆菌剂。
2.含有赤竹提取物的抗真菌剂。
3.还含有有机酸的上述2所述的抗真菌剂。
4.上述3的抗真菌剂，其中所述真菌为念珠菌。
5.含有赤竹提取物的抗病毒剂。
6.含有赤竹单宁酸的抗菌剂。
7.上述6的抗菌剂，该抗菌剂是抗金黄色葡萄球菌、丙酸杆菌、大肠杆菌的抗菌剂。
8.上述6的抗菌剂，该抗菌剂是抗MRSA的抗菌剂。
9.上述6的抗菌剂，该抗菌剂是抗疮疱丙酸杆菌的抗菌剂。
10.含有赤竹单宁酸的粉刺治疗剂。
11.含有赤竹提取物和有机酸的抗菌性组合物。
12.上述11的抗菌性组合物，该组合物为油墨、涂料、食品添加剂、饮料、调味料、宠物食品、塑料制品或粘结剂。
13.含有赤竹提取物的抗气性坏疽菌的抗菌剂。
14.上述13的抗菌剂，其中所述气性坏疽菌为梭菌属菌。
15.含有赤竹提取物的抗无芽孢厌氧性革兰氏阳性球菌的抗菌剂。
16.上述15的抗菌剂，其中所述无芽孢厌氧性革兰氏阳性球菌为Finegoldia、Micromonas、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、阿托波氏菌属(Atopobium)或孪生球菌属(Gemella)。
17.含有赤竹提取物的抗无芽孢厌氧性革兰氏阴性杆菌的抗菌剂。
18.上述17的抗菌剂，其中所述无芽孢厌氧性革兰氏阴性杆菌为普雷沃氏菌属、卟啉单胞菌属、嗜胆菌属(Bilophila)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)或梭杆菌属(Fusobacterium)。
19.含有赤竹提取物的抗阴道炎和细菌性阴道病相关微生物的抗菌剂。
20.还含有有机酸的上述13-19中任一项的抗菌剂。
21.含有赤竹提取物的调味料。
22.上述21的调味料，该调味料为含有赤竹提取物的食盐。
23.上述21或22的调味料，该调味料还含有有机酸。
24.含有赤竹提取物的农药。
25.还含有有机酸的上述24的农药。
26.含有赤竹提取物的农业用杀菌剂。
27.还含有有机酸的上述26的农业用杀菌剂。
28.含有赤竹提取物的防腐剂。
29.还含有有机酸的上述28的防腐剂。
下面，本说明书中将抗破伤风杆菌剂、抗真菌剂、抗病毒剂、粉刺治疗剂等总括简称为“抗菌剂”。
另外，本说明书中的“抗菌剂”还包括用于人以外的抗菌剂、防腐剂。
实施发明的最佳方式本发明是含有赤竹提取物作为有效成分的抗菌剂。本发明的抗菌剂含有1-50％质量，优选2-25％质量，更优选4-15％质量的为固体成分的赤竹提取物。若赤竹提取物的固体成分浓度小于1％质量，则不能充分表现出目的所在的抗菌性，而若超过50％质量，则刺激过强，因而不优选。
一直以来，通常以含有0.5-10％质量的固体成分的提取物形式制造赤竹提取物，并将其用于各种用途。因为通常将该固体成分浓度的物质以相对于最终制品为1-10％质量左右添加使用，所以最终制品中的赤竹提取物固体成分浓度通常为0.05-0.8％质量左右，即使是最高浓度的制品，其浓度也小于1％质量左右。其原因在于赤竹提取物价格较高，以这样的低浓度也能显示出一定程度的消炎效果和抗菌效果，10％质量以上的有效成分添加量是非常识的等。但以这样的低浓度，很多情况下不具备充分的抗菌效果。
本发明人发现通过含有以固体成分浓度计为1-10％质量，优选2-8％质量，更优选3-7％质量的赤竹提取物，可以使其显著表现出历来在低浓度情况下基本上未见的对特异反应性的改善效果、止痒效果，并且伤口愈合效果也显著提高(WO 02/07745)。本发明人进一步研究了赤竹提取物对各种菌类的抗菌效果，发现含有以固体成分计为1-50％重量，优选2-25％质量，更优选4-15％质量的赤竹提取物的制品对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等以外的菌，即破伤风杆菌等厌氧菌、包括疮疱丙酸杆菌在内的丙酸杆菌、念珠菌等真菌类或者疱疹病毒、流感病毒、冠状病毒等病毒等等也具有显著的抗菌效果，还发现通过使赤竹提取物中含有苹果酸等有机酸，可显著提高抗菌性，从而在以上发现的基础上完成了本发明。尽管赤竹提取物本身是很早就已知的，却至今没有进行以高浓度使用的尝试，其原因还不清楚，但令人吃惊的是，通过将浓度提高至比传统浓度更高(10倍以上)，对破伤风杆菌等厌氧菌、念珠菌等真菌类或者病毒等显示出显著的抗菌效果。
本发明对皮肤软组织传染也有效。如皮肤、骨、软组织因外伤、缺血、手术而受损伤，则会形成适于厌氧菌感染的环境。皮肤软组织感染发生于易受粪便、上呼吸道分泌物污染的部位。例如，有与肠道手术相关的伤口部位、褥疮、与人咬伤相关的伤口。从可见到气体产生的蜂窝织炎(crepitant cellulitis)、协同性蜂窝织炎、坏疽和坏死性筋膜炎的病例中可分离出厌氧菌。而且，可从皮肤的脓肿、直肠脓肿以及腋下汗腺感染(化脓性汗腺炎)分离到厌氧菌。从糖尿病患者的足溃疡也可频繁分离出厌氧菌。
皮肤软组织感染通常是多种菌感染。平均每种病例可分离出4.8个菌种，厌氧菌与需氧菌的比例为3∶2。分离频率高的细菌种有拟杆菌(Bacteroides spp.)、消化链球菌、肠球菌(Enterococcus spp.)、梭菌(Clostridium spp.)、变形菌(Preoteus spp.)。若厌氧菌与这些感染挂上关系，将会使发热频率提高、患处发出恶臭，组织内产生气体，或者发生足溃疡。
通过厌氧菌与兼性菌的协同作用而发生的坏疽(米兰尼坏疽)，其特征是强烈的疼痛、发红、肿胀及随后产生的硬结。红斑以坏死带为中心扩散。随着坏死和红斑向外侧扩大，在中心部位形成肉芽性溃疡。症状仅表现为疼痛，发热不是典型的症状。该感染常常由金黄色葡萄球菌与消化链球菌的共同作用而发生。好发部位是腹部的手术伤口、下肢的溃疡周围。治疗是通过外科方法除去坏死组织以及采用抗菌化学疗法。
坏死性筋膜炎这一快速扩展的筋膜破坏性疾病大多由A族链球菌引起，也有由消化链球菌属、拟杆菌属等厌氧菌引起的。有时会还会在组织内见到气体。与之相同，肌坏死也与厌氧菌和兼性菌的混合感染有关系。富尼埃坏疽是侵害阴囊、会阴部、腹壁前部，多种厌氧菌沿着深部的筋膜面(deep external facial planes)扩散，引起大范围皮肤缺损的蜂窝织炎。
本发明提供含有赤竹提取物的皮肤软组织感染的治疗和/或预防剂。
本发明还提供含有赤竹提取物的抗包括疮疱丙酸杆菌在内的丙酸杆菌的抗菌剂。
本发明人对赤竹提取物的有效成分进一步进行研究，结果发现赤竹提取物中较大量含有的单宁酸具有优异的抗菌作用，从而完成了本发明。历来有单宁酸具有抗菌作用的报道，但因为这些单宁酸都具有很大的副作用，所以至今没有实际应用的例子。赤竹提取物本身很早就可经口摄取，已知对人体没有副作用。这样的赤竹提取物中较大量地含有单宁酸，其具有优异的抗菌作用，这是完全没有预料到的。
作为本发明抗菌剂的有效成分，对作为赤竹提取物的原料所使用的赤竹没有特别限制，可以是赤竹属的所有赤竹。例如クマイ赤竹、山白竹、白纹阴阳竹、オクヤマ赤竹、エゾミヤマ赤竹、チマキ赤竹、ヤヒコ赤竹、オオバ赤竹、ミヤマ赤竹、センダイ赤竹、ユカワ赤竹、アボイ赤竹、オヌカ赤竹等。其中市售品的具体例子有クマイ赤竹、クマ赤竹(中国赤竹、ヒダ赤竹)等。例如优选北海道天盐山系7-10月采割的クマイ赤竹、クマ赤竹的水提取物等。
优选本发明中所用的赤竹提取物是将赤竹的鲜叶或干燥叶，优选干燥叶在100-180℃于常压或加压下用水提取得到的提取物。
对提取方法没有特别限定，可以采用例如日本专利第3212278号(日本特开平11-196818号公报)中记载的方法。更具体地说，是用加压热水提取机，在100-180℃处理5-30分钟，提取出提取物，将该提取物用水分分离器分离成含水固体成分(含水率40-70％)，然后用饱和水蒸气加热处理机将该含水固体成分在100℃-200℃处理5-60分钟，再次用加压热水提取机在100℃-180℃处理5-30分钟，提取出提取物，将第一次和第二次的提取物合并使用。也可以使用将赤竹干燥叶在例如60-100℃用水提取30分钟至12小时而得到的提取物。
作为含有50％质量的赤竹提取物固体成分的市售品，有株式会社クロロランド·モシリ制造的“AHSS”、株式会社凤凰堂的“TWEBS”。
这样得到的赤竹提取物含有硫成分，其含量以硫换算，每1g赤竹提取物的固体成分含有约4-10mg，通常约6-9mg。可认为硫成分中的主要成分是含硫氨基酸。
本发明的抗菌剂以硫换算，优选每100g含有4-500mg，更优选8-250mg，最优选16-150mg来自赤竹的硫成分。
另外，赤竹含有单宁酸，其含量相对于赤竹的固体成分为5-15％质量。
本发明的抗菌剂以固体成分浓度计优选含有0.05-7.5％质量，进一步优选0.1-6％质量的单宁酸。
本发明的抗菌剂可以仅以赤竹提取物为有效成分，也可以与适量有机酸联合使用，使其抗菌效果进一步提高。这样的有机酸有例如苹果酸、柠檬酸、乳酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、乙酸、苯甲酸、苯乙酸、水杨酸、酚类等。
有机酸在本发明抗菌剂中的用量优选为0.01-5％质量，更优选为0.02-3％质量，最优选为0.05-1.5％质量。
本发明的抗菌剂可以是赤竹提取物本身，也可以与其它成分、载体混合。
本发明提供含有赤竹提取物或者赤竹提取物与有机酸的混合物的食盐、砂糖、酱油、豆酱、辣酱油、蛋黄酱、酒、料酒、调味汁等调味料。例如，将赤竹提取物或者赤竹提取物与有机酸的混合物添加到食盐中，该食盐具有使鱼类、肉类等的保存期特别增长的效果。赤竹提取物相对于食盐的添加量，以固体成分计优选为1-10％质量，更优选2-8％质量，最优选3-6％质量。
本发明的抗菌剂的剂型可以是液态、固态、气态任何形态。本发明的抗菌剂可以采用经口给药和胃肠外给药的任何给药方式。经口给药的形态有片剂、丸剂、散剂、液剂、口香糖、糖果、巧克力、面包、糕点、荞麦面、切面、各种口服液等食品形式，胃肠外给药的形态有注射剂、局部给药剂(乳膏、软膏等)、栓剂等。作为局部给药剂型的例子，有将本发明抗菌剂含浸到天然纤维或合成纤维纱布等载体上得到的剂型，还有使本发明抗菌剂含在口红等化妆品中等。
本发明的抗菌剂不用说当然对人有效，作为除人以外的哺乳类、鸟类、鱼类、爬虫类等使用的抗菌剂也是有效的。因此，本发明的抗菌剂可以用作这些动物用抗菌剂(例如宠物用药物、宠物食品等)。除动物外，本发明的抗菌剂还可用作各种植物抗菌剂，或者可用作防腐剂。
在制造本发明的各种剂型的抗菌剂时，除使用预定量的上述赤竹提取物，还可使用通常药物组合物、化妆品、皮肤用组合物等可用的油性成分等基材成分、保湿剂、防腐剂等。
抗菌剂中所用的水可以是自来水、天然水、纯净水等，对此没有特别限定，通常优选离子交换水等高纯度水。
油性成分有例如角鲨烷、牛脂、猪脂、马油、羊毛脂、蜂蜡等动物性油；橄榄油、葡萄籽油、棕榈油、霍霍巴油、胚芽油(例如米胚芽油)等植物油；液体石蜡、高级脂肪酸酯(例如棕榈酸辛酯、棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸辛基十二烷基酯)、硅油等合成油、半合成油。
为适应皮肤的保护、提供滋润效果(用薄膜覆盖皮肤表面防止干燥，同时产生柔软性、弹性的效果)、清爽感等要求，可适当组合使用油性成分。角鲨烷、橄榄油和棕榈酸辛基十二烷基酯的组合物是一个优选例子。
为调节抗菌剂的硬度、流动性，可使用硬脂酸、硬脂醇、山萮酸、鲸蜡醇、凡士林等固体油，优选组合使用硬脂酸与鲸蜡醇。
为了将本发明的抗菌剂制造成乳膏组合物，可使用用于将赤竹提取物、水、油性成分制成膏状的膏化剂，对膏化剂没有特别限定，通常是将甘油一硬脂酸酯与自乳化型甘油一硬脂酸酯(向甘油一硬脂酸酯中添加乳化剂后形成的物质)组合使用。
还可以根据需要使本发明的抗菌剂含有稳定剂、保湿剂、伤口愈合剂、防腐剂、表面活性剂等。
稳定剂的例子有羧基乙烯基聚合物与氢氧化钾的组合、聚乙二醇二硬脂酸酯等。特别是聚乙二醇倍半硬脂酸酯(聚乙二醇二硬脂酸酯与聚乙二醇一硬脂酸酯的1∶1混合物)(聚乙二醇的分子量为1000至2万)的稳定性高，水与油不分离，并且可有效调节作为膏状组合物涂布于皮肤上时的硬度，因而优选。
保湿剂的例子有透明质酸钠、胶原、芦荟提取物(特别优选提取自木本芦荟的芦荟提取物(2))、尿素、1，3-丁二醇、甘油、海藻糖、山梨糖醇、氨基酸、吡咯烷酮羧酸钠等。
伤口愈合剂的例子有尿囊素、甘草酸二钾、甘草提取物、艾提取物等。
由于赤竹提取物本身具有抗菌作用，因而仅辅助性使用防腐剂。例如苯甲酸钠、对羟基苯甲酸低级烷基酯(例如甲酯、乙酯、丙酯或丁酯等称为对羟基苯甲酸酯的化合物)、丙酸钠、混合脂肪酸酯(癸酸甘油酯、聚甘油-2月桂酸酯、聚甘油-10月桂酸酯的混合物)、苯氧基乙醇、201号感光素(黄色色素)、1，2-戊二醇等，但优选对羟基苯甲酸酯、混合脂肪酸酯、1，2-戊二醇。
表面活性剂的例子有N-酰基-L-谷氨酸钠、聚氧乙烯山梨糖醇酐单硬脂酸酯等。
还可以根据需要含有芳香成分，例如橙油、柠檬油、橙皮油、香料等。
在以上各成分中加入水，再根据需要加入有机酸，使总量为100％质量。
将本发明抗菌剂制成膏状组合物时各成分的优选混合量(％质量)如下表1所示。水分以外的各种成分的混合量是除去水分后的％质量。
表1

将上述各成分投入装备有搅拌叶和优选装备有乳化器的加热混合釜中，在70-90℃搅拌混合1-2小时，得到本发明的抗菌剂。
本发明的抗菌剂除膏状组合物外，还可以以软膏、液体、凝胶状、气溶胶和其它形态使用，但膏状组合物的形态简便，且效果也好。另外也可以是洗发剂、沐浴皂(body soap)、洗面奶等半固体或液体形态。
清洁患处后，将本发明的抗菌剂适量涂布，例如以膏状组合物形式时，每100cm2皮肤涂布0.1-1g左右，每日涂布1-5次，通常涂布1-3次即可。涂布量、涂布次数可根据症状、伤口的程度适当增减。
经口摄取本发明的抗菌剂时，作为赤竹提取物固体成分，每1kg体重的适合摄取量为0.01-0.1g左右，每日摄取1-5次，通常1-3次。摄取量、摄取次数可根据症状适当增减。
当将本发明的抗菌剂以注射剂等形式胃肠外给药时，作为赤竹提取物固体成分，每1kg体重的适当摄取量为0.01-0.1g左右，每日摄取1-5次，通常1-3次。摄取量、摄取次数可根据症状适当增减。
通过将本发明的抗菌剂预先涂布于避孕套上，可预防性病、HIV感染等。
作为本发明抗菌剂有效成分的赤竹提取物是箬属的提取物，其1.25％质量的水溶液对人胎儿肾脏的293细胞未显示毒性。
本发明的抗菌剂含有1-50％质量的赤竹提取物固体成分，对破伤风杆菌、引起气性坏疽的梭菌属气性坏疽菌群、念珠菌、发癣菌、毛霉菌、根霉、曲霉属菌、隐球菌属菌、球孢子菌属菌、ヒト组织胞浆菌属菌、MRSA等抗生物耐性菌，包括疮疱丙酸杆菌在内的丙酸杆菌属菌、疱疹病毒、流感病毒、管状病毒等病毒等显示显著的抗菌效果。
本发明抗菌剂的优选实施方式如下所述。
1.含有赤竹提取物(以固体成分计算为1-50％质量)、水、油性成分和膏化剂的抗菌剂。
2.上述1中记载的抗菌剂，其中所述油性成分为至少一种选自动物性油、植物性油、合成油和半合成油的物质。
3.上述1中记载的抗菌剂，其中所述油性成分为至少一种选自角鲨烷、牛脂、猪脂、马油、羊毛脂、蜂蜡、橄榄油、葡萄籽油、棕榈油、霍霍巴油、胚芽油、液体石蜡、棕榈酸辛酯、棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸辛基十二烷基酯、硅油、硬脂酸、硬脂醇、山萮酸、鲸蜡醇和凡士林的物质。
4.上述1-3中任一项的抗菌剂，其中所述膏化剂为甘油一硬脂酸酯与自乳化型甘油一硬脂酸酯的组合。
5.上述1-4中任一项的抗菌剂，该抗菌剂还含有至少一种选自有机酸、稳定剂、保湿剂、伤口愈合剂、防腐剂和表面活性剂的成分。
6.上述5中记载的抗菌剂，其中所述稳定剂为至少一种选自羧基乙烯基聚合物与氢氧化钾的组合、聚乙二醇二硬脂酸酯的物质。
7.上述5中记载的抗菌剂，其中所述保湿剂为至少一种选自透明质酸钠、胶原、芦荟提取物、尿素、1，3-丁二醇、甘油、海藻糖、山梨糖醇、氨基酸和吡咯烷酮羧酸钠的物质。
8.上述5中记载的抗菌剂，其中所述伤口愈合剂为至少一种选自尿囊素、甘草酸二钾、甘草提取物和艾提取物的物质。
9.上述5中记载的抗菌剂，其中所述防腐剂为至少一种选自苯甲酸钠、对羟基苯甲酸低级烷基酯、丙酸钠、混合脂肪酸酯、苯氧基乙醇、1，2-戊二醇和黄色色素的物质。
10.上述5中记载的抗菌剂，该抗菌剂还含有至少一种选自橙油、柠檬油、橙皮油和香料的成分。
11.一种抗菌剂，该抗菌剂含有赤竹提取物、水、油性成分、膏化剂、稳定剂、保湿剂、伤口愈合剂、防腐剂和表面活性剂，其中所述油性成分为至少一种选自角鲨烷、牛脂、猪脂、马油、羊毛脂、蜂蜡、橄榄油、葡萄籽油、棕榈油、霍霍巴油、胚芽油、液体石蜡、棕榈酸辛酯、棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸辛基十二烷基酯、硅油、硬脂酸、硬脂醇、山萮酸、鲸蜡醇和凡士林的物质，所述膏化剂为甘油一硬脂酸酯与自乳化型甘油一硬脂酸酯的组合，所述稳定剂为至少一种选自羧基乙烯基聚合物与氢氧化钾的组合、聚乙二醇二硬脂酸酯的物质，所述保湿剂为至少一种选自透明质酸钠、胶原、芦荟提取物、尿素、1，3-丁二醇、甘油、海藻糖、山梨糖醇、氨基酸和吡咯烷酮羧酸钠的物质，所述伤口愈合剂为至少一种选自尿囊素、甘草酸二钾、甘草提取物和艾提取物的物质，所述防腐剂为至少一种选自苯甲酸钠、对羟基苯甲酸低级烷基酯、丙酸钠、混合脂肪酸酯、苯氧基乙醇和黄色色素的物质，所述表面活性剂为N-酰基-L-谷氨酸钠。
12.上述11中记载的抗菌剂，该抗菌剂还含有至少一种选自橙油、柠檬油、橙皮油和香料的成分。
13.上述1中记载的抗菌剂，该抗菌剂含有赤竹提取物、水、角鲨烷、橄榄油、甘油一硬脂酸酯、自乳化型甘油一硬脂酸酯、羧基乙烯基聚合物、氢氧化钾、尿素、1，3-丁二醇、尿囊素、对羟基苯甲酸低级烷基酯、硬脂酸、N-酰基-L-谷氨酸钠、柠檬油。
14.上述1中记载的抗菌剂，该抗菌剂含有赤竹提取物、水、角鲨烷、橄榄油、肉豆蔻酸辛基十二烷基酯、鲸蜡醇、甘油一硬脂酸酯、自乳化型甘油一硬脂酸酯、羧基乙烯基聚合物、氢氧化钾、尿素、1，3-丁二醇、尿囊素、混合脂肪酸酯、硬脂酸、N-酰基-L-谷氨酸钠、橙油。
15.上述1-14中任一项记载的抗菌剂，该抗菌剂含有聚乙二醇倍半硬脂酸酯。
16.上述1-15中任一项记载的抗菌剂，其中有机酸为至少一种选自苹果酸、柠檬酸、乳酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、乙酸、苯甲酸、苯乙酸、水杨酸和酚类的物质。
本发明还提供含有赤竹提取物和有机酸的抗菌性组合物。本发明抗菌性组合物的优选形式还有油墨、涂料、食品添加剂、饮料、宠物食品、塑料制品和粘结剂。
当采用食品添加剂、饮料(清凉饮料、果汁、蔬菜汁、酒类(日本酒、啤酒、发泡酒、威士忌、烧酒、伏特加、葡萄酒、白兰地)等水性材料作为这些抗菌性组合物的原料时，可以向这些原料中加入赤竹提取物和有机酸进行混合。可以在制造原料之前、制造过程中、制造后的任何阶段添加。添加赤竹提取物和有机酸后，在70-90℃搅拌混合处理1-2小时，这样可进一步提高抗菌性。食品添加剂、饮料等抗菌性组合物中的赤竹提取物含量优选为0.1-20％质量，更优选为0.25-7％质量。
当采用油墨、涂料、塑料制品、粘结剂等作为这些抗菌性组合物的原料时，若这些原料是亲水性的，则与上述情况一样，可以将赤竹提取物和有机酸添加到原料中进行混合。可以在原料制造前、制造过程中、制造后的任何阶段添加。另一方面，若这些原料为疏水性(亲油性)，则很多情况下赤竹提取物和有机酸难以混合。这时，最好采取下述方法改善与原料的混合性将赤竹提取物或者赤竹提取物和有机酸的混合物与表面活性剂(乳化剂)或亲水性有机溶剂(例如甲醇、乙醇等醇类；丙酮等酮类；乙酸乙酯等酯类；吡啶；二甲基甲酰胺等)结合使用，改善混合性；或者将赤竹提取物或者赤竹提取物和有机酸的混合物预先用亲油性材料进行微胶囊化等。任何情况下都可在添加赤竹提取物和有机酸后，通过在70-90℃搅拌混合处理1-2小时，使抗菌性进一步得到提高。
使用油墨、涂料、塑料制品、粘结剂等作为原料时，本发明抗菌性组合物中赤竹提取物的含量优选为1-20％质量，更优选为3-7％质量，有机酸的含量优选为0.1-10％质量，更优选为3-7％质量。
特别优选的有机酸是苹果酸、琥珀酸、柠檬酸等。
本发明的抗菌性组合物与不含本发明抗菌剂的物质相比，具有显著的抗菌性，油墨、涂料作为抗菌性建材不用说自然是适用于一般家庭的，作为有可能发生院内感染的医院或公共建筑用的建材也是极为有用的。
下面，给出参考例、实施例和试验例，进一步详细说明本发明。参考例1赤竹提取物的制备将9月份在北海道天盐山系采集的赤竹干燥叶放入加压热水提取罐中，在125℃处理10分钟，用冷却水将热水冷却至80℃，将提取物与含水固体成分通过螺旋压力机分离，使含水率为约50％质量。然后将约50％质量含水固体成分放入高压釜中，在180℃用饱和水蒸气加压热处理10分钟。将处理后的含水固体成分再次放入加压热水提取罐中，在110℃处理5分钟，抽提出提取物。合并第一次和第二次的提取物，经硅藻土过滤，减压浓缩至固体成分为50％质量，在110-130℃进行流动灭菌处理，得到赤竹提取物。
该赤竹提取物中的硫含量为3850μg/ml(7.7mg/lg固体成分)。
参考例2分析赤竹提取物(Bambuseae Sasa)(从株式会社凤凰堂获得)的成分，得到下述结果。
水 59.5％质量蛋白质 8.6脂质0.6矿物质 9.0碳水化合物 19.8单宁酸 2.5实施例1-4将下述表2中的成分以表2所示质量比混合，投入装有搅拌叶和乳化器的加热混合釜，在80℃搅拌混合2小时，得到本发明的抗菌剂。实施例1-4中固体成分浓度8％质量的赤竹提取物(将参考例1中制备的固体成分50％质量的赤竹提取物用水稀释而成)的添加量分别为12.5、25、37.5和75％质量(因此，赤竹提取物固体成分的含量为1、2、3和6％质量，100g抗菌剂中的硫含量为7.7mg、15.4mg、23.1mg和46.2mg)。
表2


比较例1将固体成分浓度8％质量的赤竹提取物(将参考例1中制备的固体成分50％质量的赤竹提取物用水稀释而成)的添加量改为6.2％质量(从而赤竹提取物固体成分的含量为0.5％质量，100g抗菌剂中的硫含量为3.8mg)，除此之外与实施例1一样操作，制得比较例1的抗菌剂。
实施例5将下述表3中的成分以表3所示质量比混合，与实施例1-4同样操作，制得本发明的抗菌剂。
表3


100g该抗菌剂中的硫含量为46.2mg。
实施例6将下述表4中的成分以表4所示质量比混合，投入装有搅拌叶和乳化器的加热混合釜中，在80℃搅拌混合2小时，制得本发明的抗菌剂。
表4


该膏的pH为6.00。
实施例7将下述表5中的成分以表5所示质量比混合，投入装有搅拌叶和乳化器的加热混合釜中，在80℃搅拌混合2小时，制得本发明的抗菌剂膏。
表5


该膏的pH为4.68。
实施例8-10不添加dl-苹果酸，将赤竹提取物(固体成分含量50％质量)的量变为16％质量、20％质量和30％质量，并调节纯净水的量，除此之外与实施例7一样操作，制得赤竹提取物固体成分含量为8％质量、10％质量和15％质量的本发明抗菌剂膏。
实施例11-13将赤竹提取物(固体成分含量50％质量)的量变为16％质量、20％质量和30％质量，并调节纯净水的量，除此之外与实施例7—样操作，制得赤竹提取物固体成分含量为8％质量、10％质量和15％质量的本发明抗菌剂膏。
试验例1(对破伤风杆菌的抗菌活性)使用26株破伤风梭菌(Clostridium tetani)。这些菌株是从日本的土壤中分离得到的。使用大肠杆菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923作为对照。
将参考例1中制备的赤竹提取物(赤竹提取物固体成分含量为50％质量)用无菌蒸馏水稀释，制成赤竹提取物水溶液。
通过琼脂平板稀释法测定各种浓度赤竹提取物水溶液的最低抑菌浓度。制作改良GAM琼脂平板(日水制药)，使最终浓度为12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.19、0.10％质量。将赤竹提取物水溶液与2倍琼脂培养基以1∶1混合，制成含有预定浓度的赤竹提取物的琼脂培养基。为防止破伤风杆菌畸变，将琼脂浓度补正到3％。在琼脂被调节到3％的改良GAM琼脂培养基培养24小时，用接种环将得到的受试菌株的菌落取出，使其悬浮于厌氧菌培养液(Difco)中，将浊度调节至Mc Farland No.1。将其1μl(接种量105cfu)通过划线法接种于含有赤竹提取物的平板系列上。对照菌株则使用血液琼脂培养基上的菌落，在厌氧菌培养液(Difco)中，将浊度调节至McFarland No.0.5，将其1μl(接种量105cfu)通过划线法进行接种。另外，在厌氧工作站(グンゼ产业)中于35℃培养18小时后，通过肉眼观察有没有生长。确认有生长时，判定为(+)。
通过该方法测定的赤竹提取物对大肠杆菌ATCC25922和葡萄球菌ATCC25923的最低抑菌浓度都为3.13％质量。
对26株破伤风杆菌最低抑菌浓度分布在0.78％质量至0.19％质量。结果如表6所示。赤竹提取物对80％或50％菌株的破伤风杆菌所用菌株的最低抑菌浓度(MIC80％和MIC50％)分别为0.78％和0.39％。
表6


破伤风是以土壤中存在的破伤风杆菌的芽胞与土壤一起侵入伤口部位为契机而发病的疾病。芽胞在局部发芽、增殖并产生毒素(破伤风痉挛毒素)，这是发病必不可少的条件。受污染的伤口部位容易形成芽胞发芽所需的厌氧环境，因此预防破伤风的根本是进行称为清创术的适当外科处置，除去侵入的异物、坏死组织等，阻止伤口部位形成厌氧性环境，防止破伤风杆菌的增殖。
如表6所示，赤竹提取物以0.78％的低浓度即可完全抑制所有26株破伤风杆菌的增殖。可知赤竹提取物的抗菌活性是对大肠杆菌、葡萄球菌的抗菌活性的4倍以上。
对在与不含赤竹提取物的培养基中的生长没有差别的浓度(0.19％)下进行菌株生长而得到的破伤风杆菌进行单一染色并用显微镜观察，可观察到菌体形成丝状和菌体膨胀出现溶菌的图象。在菌株生长与不含赤竹提取物的培养基中的生长相比明显得到抑制的浓度(0.38％)下，可见显色性差的菌体，且可容易地见到具有芽胞的菌体。在电子显微镜水平已观察到，葡萄球菌中显示胞壁的形成受到阻碍。通过对抗生物质的研究可知，在最低抑菌浓度以下的浓度所见到的丝状形成是在分裂时向毛句的气形成受到阻碍时所见到的现象。
气性坏疽是具有与破伤风类似的发病机理的与外伤相关连的疾病，赤竹提取物对引起气性坏疽的几种厌氧菌即产气荚膜梭菌(Closdtridium perfringens)、败毒梭菌(Clostridium septicum)、双酶梭菌(Clostridium bifermentans)等气性坏疽菌群的抗菌活性以及引起脓性感染的无芽同胞厌氧菌的抗菌活性也受到关注。
试验例2(对念珠菌的抗菌活性)研究实施例8-13中配制的赤竹提取物以及含有赤竹提取物和苹果酸的膏状组合物对念珠菌(白色念珠菌(Candida albicans)临床分离株)的抗菌活性。
所用培养基·NB培养基添加0.2％肉膏的普通肉汤(荣研化学)·1/50 NB培养基将NB培养基用磷酸缓冲液稀释至50倍，并将pH调节至7.2±0.2。
·SCDLP肉汤(荣研化学)·SA培养基标准琼脂培养基(日水制药)菌液的调整在实施试验前一天，将纯培养的新鲜培养菌以约108个/ml悬浮于1/50NB培养基中，将Mc Farland调节至0.5。再用1/50NB培养基将菌液稀释100倍(约106个/ml)。
将膏状组合物在60℃加热10分钟，使膏状组合物熔融。将1ml熔融后的膏状组合物滴加到丙烯酸酯板(50mm×50mm)上，在室温下放置10分钟，使其固化。将0.5ml菌液滴加到膏状组合物涂布面上，在其上将紧密贴合丙烯酸酯板(45mm×45mm)。将其在高湿度下于36℃培养24小时。
向无菌玻璃皿中装入10ml的SCDLP肉汤，将培养24小时后的丙烯酸酯板移入其中，用肉汤冲洗丙烯酸酯板。取其100μl，滴加到SA培养基上，将其均匀涂抹展开，培养48小时后，测定菌数，换算成每1块丙烯酸酯板上的菌数。结果如表7所示。
表7


对照实施例7中未添加dl-苹果酸和赤竹提取物。
含有赤竹提取物但不含苹果酸的膏状组合物(试验编号3-5)对念珠菌基本上没有抗菌活性，但含有赤竹提取物和苹果酸的膏状组合物(试验编号6-8)，特别是赤竹提取物浓度为10％质量以上时显示出高抗菌活性。
试验例3(对疱疹病毒的治愈效果)将实施例7中制备的膏状组合物(赤竹提取物固体成分含量为6％质量)在疱疹病毒感染患者(60岁、女)的患处(口角)每日适量涂布2次，2天内症状明显减轻，3天完全治愈。
试验例4(对来自粉刺患者病灶的菌株的分析)从粉刺患者的病灶分离得到下述44株金黄色葡萄球菌和26株丙酸杆菌属菌。
表8


上述44株金黄色葡萄球菌的抗生物质敏感性如下所述。(μg/ml)表9

上述26株丙酸杆菌属菌的抗生物质敏感性如下所述。(μg/ml)表10

试验例5(参考例2的赤竹提取物的抗菌性)在琼脂培养基上，通过2倍稀释法研究参考例2的赤竹提取物(赤竹单宁酸)和市售的单宁酸(批号02060618，Extrasynthese，Geney，France)的抗菌性(MIC(mg/ml)最低抑菌浓度)。结果如下所示。
表11

()内的数值是作为赤竹单宁酸的MIC值。
试验例6(参考例2的赤竹提取物的抗菌性)用试验例4中从粉刺患者的病灶分离得到的44株葡萄球菌属细菌(混合物)和26株丙酸杆菌属菌(混合物)，在琼脂培养基上，通过2倍稀释法研究参考例2的赤竹提取物(赤竹单宁酸)和市售的单宁酸(批号02060618，Extrasynthese，Geney，France)的抗菌性(MIC(mg/ml)抑制生育的最低浓度)。结果如下所示。将葡萄球菌的菌株在MH琼脂(Mueller Hinton琼脂(BBL))培养基上、pH7.0、空气中、37℃培养24小时，将丙酸杆菌在GAM培养基、pH7.0、厌氧环境中、35℃培养48小时。市售单宁酸的MIC80对葡萄球菌属菌群为0.04mg/ml，对丙酸杆菌为0.08mg/ml。
表12

实施例14向100质量份水性油墨中加入6质量份参考例1中制备的赤竹提取物和10质量份dl-苹果酸，在80℃混合加热处理2小时，得到抗菌性油墨。
实施例15向100质量份水性涂料中加入6质量份参考例1中制备的赤竹提取物和10质量份dl-苹果酸，在80℃混合加热处理2小时，得到抗菌性涂料。
实施例16向100质量份日本酒中加入3质量份参考例1中制备的赤竹提取物和0.25质量份dl-苹果酸，在80℃混合加热处理3小时，得到抗菌性日本酒。
实施例17向100质量份水性粘结剂中加入6质量份参考例1中制备的赤竹提取物和10质量份dl-苹果酸，在80℃混合加热处理2小时，得到抗菌性粘结剂。
试验例7(对10株气性坏疽菌群产气荚膜梭菌的抗菌作用)所用菌株使用了1株产气荚膜梭菌ATCC13124和9株临床分离的产气荚膜梭菌(GAI-92099、GAI-92100、GAI-92101、GAI-92102、GAI-92103、GAI-92104、GAI-92105、GAI-92106、GAI-92107)合计10株。这些临床分离菌株是从感染患者的临床材料中分离得到、保存于岐阜大学医学部附属厌氧菌实验设施(以下称为“所述设施”)的菌株。另外，用大肠杆菌ATC25922作为评价抗菌能力的精度控制用菌株。
赤竹提取物溶液的固体成分浓度为50％，包含水溶性蛋白·氨基酸、矿物质、单宁酸、糖类、水溶性多糖、羧酸、总叶绿素、硅酸、维生素、脂质、精油、水分。原液的pH约为5.0。使用无菌蒸馏水稀释溶液。
抗菌试验按照抗菌药的抗菌能力测定法中所用的琼脂平板稀释法，测定最低抑菌浓度，以％表示。制备赤竹提取物的2倍稀释水溶液系列，使终浓度为25％至0.2％。将赤竹提取物稀释液与改良GAM琼脂培养基(2倍)以1∶1混合，制成最终含有12.5-0.1％浓度的赤竹提取物的改良GAM琼脂培养基。在改良GAM琼脂培养基中培养24小时，将得到的受试菌株的菌落用无菌棉棒取出，使其悬浮于厌氧菌肉汤(Difco)中，调整成浊度为Mc Farland No.1的菌液。将其10μl(接种量106cfu)通过划线法接种于含有赤竹提取物的平板系列上。对于对照菌株大肠杆菌，则用TSA琼脂培养基(Difco)上的菌落，在厌氧菌肉汤中将浊度调节至Mc Farland No.0.5，将其10μl(接种量105cfu)通过划线法进行接种。并在厌氧工作站(グンゼ产业)中于35℃培养18小时后，通过肉眼观察有没有生长。确认有生长时，判定为(+)。通过本方法测定的赤竹提取物对大肠杆菌ATCC25922的最低抑菌浓度都为3.13％。
结果抑制10株产气荚膜梭菌生长所必需的赤竹提取物的最低浓度分布于3.13-6.25％。抑制80％或50％的产气荚膜梭菌所用菌株生长的赤竹提取物浓度为6.25％。
表13赤竹提取物对10株产气荚膜梭菌的抗菌作用

考察气性坏疽是以存在于土壤中称为气性坏疽菌群的1群梭菌的芽胞与土壤一起侵入伤口部位为契机而发病的疾病。已知产气荚膜梭菌、败毒梭菌、双酶梭菌等都是病原菌，但气性坏疽病例的80％是由产气荚膜梭菌引发的。已知气性坏疽是通过急救外科的适当治疗可充分预防的疾病，但在外科处置太迟的情况下，或者外科处置不十分恰当的情况下，在受伤后6小时以后发病，经过剧烈的过程，最后引起死亡。或者，为了挽救生命，只能切除四肢等患处，这是医疗上不能轻视的一种疾病。
根据这次试管阶段的研究结果可知，虽然赤竹提取物对产气荚膜梭菌的抗菌作用比不上试验例1中所探讨的对破伤风梭菌的作用，但以3.13％以上～6.25％以下的浓度即可完全抑制10株产气荚膜梭菌的增殖。因此，含浸有这种浓度水平的赤竹提取物的患处保护布等超过了对产气荚膜梭菌的最低抑菌浓度，在受伤后接受外科医生的适当治疗之前，作为应急处理用于人体时，可以说具有抑制受伤部位的产气荚膜梭菌发芽或其发芽后的增殖的作用。
试验例8(对产气荚膜梭菌以外的气性坏疽菌群的抗菌作用)所用菌株使用从来自感染患者的临床材料分离得到的或保存于所述设施的参考菌株。用大肠杆菌ATC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923作为评价抗菌能力的精度控制用菌株。使用与试验例7一样的试验液。
抗菌试验按照抗菌药的抗菌能力测定法中所用的琼脂平板稀释法，测定最低抑菌浓度，以％表示。制备含有赤竹提取物的改良GAM琼脂培养基，使终浓度为8％至0.125％。将培养基的pH调节至7.0。在改良GAM琼脂培养基中培养24小时，将得到的受试菌株的菌落通过无菌棉棒取出，使其悬浮于厌氧菌肉汤(Difco)中，调整成浊度为Mc Farland No.1的菌液。将其10μl(接种量106cfu)通过划线法接种于含有赤竹提取物的平板系列上。对于对照菌株大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，则用TSA琼脂培养基(Difco)上的菌落，在厌氧菌肉汤中将浊度调节至Mc Farland No.0.5，将其10μl(接种量105cfu)通过划线法进行接种。并在厌氧工作站(グンゼ产业)中于35℃培养18小时后，通过肉眼观察有没有生长。确认有生长时，判定为(+)。结果如表14所示。
表14赤竹提取物对气性坏疽菌群梭菌的抗菌作用

考察可知赤竹提取物可抑制诺氏梭菌和生孢梭菌生长的浓度为3％，可抑制败毒梭菌生长的浓度为3-5％，可抑制双酶梭菌、索氏梭菌生长的浓度为5-7％。即，虽然赤竹提取物对与气性坏疽相关的梭菌的抗菌作用因菌种不同而存在差异，但只要具有7％的浓度，则可抑制所用全部菌株的增殖。为预防气性坏疽而对伤口部位使用本提取物时，最好在pH7的条件下，设定为7％的浓度。
试验例9(对16株疮疱丙酸杆菌的抗菌作用)所用菌株使用疮疱丙酸杆菌ATCC11827和15株临床分离菌株(GAI-10341、GAI-10342、GAI-10343、GAI-10344、GAI-10345、GAI-10346、GAI-10347、GAI-10348、GAI-10349、GAI-10350、GAI-10351、GAI-10352、GAI-10353、GAI-10354、GAI-10355)合计16株。这些临床分离株是从皮肤科感染患者分离得到并保存于所述设施的菌株。使用与试验例7一样的试验液。使用无菌蒸馏水进行稀释。
抗菌试验按照抗菌药的抗菌能力测定法中所用的琼脂平板稀释法，测定最低抑菌浓度。以日本化学疗法学会标准法为基准。制备含有赤竹提取物的改良GAM琼脂平板(日水制药)，使终浓度为12.5、6.25、3.13、1.56、0.78％。将赤竹提取液与2倍琼脂培养基以1∶1混合，制成含有预定浓度的赤竹提取物的琼脂培养基。不对pH进行调节。
在布鲁氏菌HK半流动培养基(极东制药)上培养48小时，从得到的受试菌株的浓厚生长部位取1接种环菌株，通过划线法接种于含有赤竹提取物的平板系列上。在本实验条件下，1接种环含有108/ml的细菌数。在厌氧工作站(グンゼ产业)中于35℃培养2天后，通过肉眼观察有没有生长。确认有生长时，判定为(+)。
结果完全抑制16株疮疱丙酸杆菌生长所需的赤竹提取物的最低浓度(MIC)为6.25％(表15)。赤竹提取物对16株疮疱丙酸杆菌中的12株，在3.13％时比不含赤竹提取物的对照培养基具有更显著的生长抑制作用，完全抑制需要6.25％。
表15赤竹提取物对16株疮疱丙酸杆菌的抗菌作用


考察虽然抑制与寻常痤疮相关的金黄色葡萄球菌所需的赤竹提取物浓度为3.13％，但在本试验例的探讨中，完全抑制疮疱丙酸杆菌所有菌株所需的赤竹提取物浓度在3.13％以上～6.25％以下的浓度范围内。因为疮疱丙酸杆菌与金黄色葡萄球菌都是重要的寻常痤疮加重因子，所以当目的在于治疗寻常痤疮时，能完全抑制疮疱丙酸杆菌生长的适当浓度可考虑6.25％左右。
现在还不明白赤竹提取物具有这样的抗菌作用的机理，其原因有可能是作为植物的赤竹提取物与至今为止来自放线菌或来自真菌的各种抗菌药具有不同的作用机理，耐药性表达这方面也值得研究。
试验例10(对26株来自粉刺的疮疱丙酸杆菌的抗菌作用)所用菌株使用总共26株疮疱丙酸杆菌临床分离株。这些临床分离株是分离自粉刺患者并保存于所述设施的菌株。使用与试验例7一样的试验液，是浓度为50％的酸性(pH5.0左右)溶液。使用无菌蒸馏水进行稀释。
抗菌试验按照抗菌药的抗菌能力测定法中所用的琼脂平板稀释法，测定最低抑菌浓度。以日本化学疗法学会标准法为基准。制备含有赤竹提取物的改良GAM琼脂平板(日水制药)，使终浓度为8、7、6、5、4、3、2、1、0.5％。将pH调节至7.0附近。将在GAM琼脂培养基中培养48小时后得到的受试菌株的菌落悬浮于厌氧菌肉汤中，调整为含有预定菌数的菌液。在厌氧工作站(グンゼ产业)中于35℃培养2天后，通过肉眼观察有没有生长。
结果与考察以下，参考地给出对各种抗菌药的敏感性分布，虽然这不是与本试验同时进行得到的结果。本试验与在未调节pH情况下实施的上一试验不同，终点的判定很困难。
表16疮疱丙酸杆菌(26株)对赤竹提取物和各种抗菌药的敏感性

试验例11(赤竹提取物对乳杆菌的抗菌作用)所用菌株使用表17所示的由机构保存的参考菌株。这些菌株是从ATCC、JCM购入并保存于所述设施的菌株。从细菌性阴道病妇女的阴道内或妇科领域感染中可较高频率分离的代表性菌种中选取二路普雷沃氏菌ATCC29303、不解糖卟啉单胞菌(Porphyromonasasaccharolytica)ATCC25260、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)N-1、N-2作为对照。另外，出于同样的目的，用大肠杆菌ATC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923作为敏感性测定的精度控制用菌株。试验液与试验例7相同。
用无菌蒸馏水稀释赤竹提取物原液，放置一会儿后，有时会生成棕褐色的沉淀物，与培养基混合稀释时，要将其充分搅拌混合使用。
抗菌试验按照抗菌药的抗菌能力测定法中所用的琼脂平板稀释法，测定最低抑菌浓度(MIC)。以日本化学疗法学会标准法为基准。制备含有赤竹提取物的改良GAM琼脂平板(日水制药)，使终浓度为10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5％。对于10％-6％的高浓度区域，分别用20％-12％的赤竹提取液与2倍琼脂培养基以1∶1混合制作(最终pH5.3-5.5)，对5％-0.5％的低浓度区域，将50％-5％的赤竹提取液与1倍琼脂培养基以1∶9混合(最终pH5.5-6.0)，制成含有赤竹提取物的琼脂培养基。
另外，这次抗菌能力的探讨除在酸性(pH5.3-6.0)条件下外，在更弱酸性至环境酸性下实施。将添加赤竹提取物后的pH用2N的NaOH水溶液调节至pH6.5-7.0，制作调整后的培养基。
接种菌的调整在布鲁氏菌HK血液琼脂培养基中培养48小时，将转移得到的受试菌株的菌落用无菌棉棒取出，使其悬浮于厌氧菌肉汤MIC(Difco)中，调整浊度为Mc Farland No.1。将其10μl(接种量106cfu)通过划线法接种于含有赤竹提取物的平板系列上。对于对照菌株，则用TSA琼脂培养基上的菌落，在厌氧菌肉汤MIC中将浊度调节至Mc Farland #1，将其10μl(接种量106cfu)通过划线法进行接种。这次，对大肠杆菌ATC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923，同时测定Mc Farland#1/2、1/2的10倍稀释液、1/2的100倍稀释液的MIC，探讨接种菌量对MIC的影响。
在厌氧工作站(グンゼ产业)中于35℃培养18小时后，通过肉眼观察有没有生长。确认有生长时，判定为(+)。
结果在未调节pH的酸性(pH5.3-6.0)实验条件下测定的赤竹提取物的最低抑菌浓度如表17所示。对于干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacilluscasei ss.casei)、短乳杆菌短亚种(Lactobacillus brevis ss.brevis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)4菌种4株为7-8％，对除该4菌种4株外的另外5菌种5株为10％以上。另外，对于同时测定的二路普雷沃氏菌ATCC29303、不解糖卟啉单胞菌ATCC25260的最小抑菌浓度都是0.5％；对于2株赤竹提取物的精度控制用菌株大肠杆菌ATC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923，通过本方法测定的最低抑菌浓度都为4％。
在调节pH(pH6.8-7.1)的实验条件下测定的赤竹提取物的最低抑菌浓度如表1所示。对短乳杆菌短亚种、嗜酸乳杆菌这2菌种2株是7％，对除该2菌种2株外的另外7菌种7株为＞＝9％。二路普雷沃氏菌为1％，不解糖卟啉单胞菌为0.5％。大肠杆菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923的MIC为6％。
在求调节pH(pH6.4-7.0)条件下的MIC时，用大肠杆菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923探讨接种菌量对MIC的影响。结果，在使用1接种环量的浊度为Mc Farland#1-1/2(＞108/ml)的金黄色葡萄球菌菌液时，MIC为6％，在使用Mc Farland#1/2的10倍(107/ml)、100倍稀释液(106/ml)时，MIC为3％。虽然大肠杆菌随接种菌量的变化，菌的生长程度在subMIC区域阶段性地变差，但读取的MIC值没有变动，都是6％。
考察由上述试验可知，赤竹提取物以6.25％-3.13％以下的浓度即可抑制一些病原性细菌的生长。除赤竹提取物对这些病原性细菌的抗菌能力外，积累关于其对非病原性细菌的抗菌能力的信息也是极为重要的，因此实施了本试验例。
从机体防御的观点考虑，多数乳杆菌在人粘膜中都扮演着重要的角色。本发明人已从29名健康孕妇的阴道分离出了91株乳杆菌，对这些乳杆菌进行详细鉴别，结果发现卷曲乳杆菌(Lactobaciluscrispatus)最多，有48株(52.7％)，加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)次之，有19株(20.85％)，然后是阴道乳杆菌(Lactobacillus vaginalis)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、唾液乳杆菌等。其中，100％的卷曲乳杆菌产生过氧化氢，是产量很多的乳杆菌的代表性菌种，并且认为其与不是100％但据报道存在产生过氧化氢的菌株的加氏乳杆菌、阴道乳杆菌这2个菌种一起，在女性的阴道和子宫粘膜内的感染防御机构中起着特别重要的作用。通过这次探讨可知，赤竹提取物对作为产生过氧化氢的乳杆菌的卷曲乳杆菌和加氏乳杆菌的抗菌作用MIC为10％以上，与同时实施的对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等代表性病原性兼性菌的MIC为4％以及对二路普雷沃氏菌、不解糖卟啉单胞菌、脆弱拟杆菌等代表性化脓性厌氧菌的MIC为0.5-4％相比，其抗菌作用特别弱。
并且已知，赤竹提取物溶液具有与阴道内环境的pH相近的pH，在中性条件下比在碱性条件下能发挥更强的抗菌作用，而在酸性条件下又比在中性条件下能发挥更强的抗菌作用。将对参考菌株大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抗菌能力低2管左右的pH稍微移到中性附近，即使在这样的弱酸性实验条件下，乳杆菌的MIC也没有大的变化。
本发明人还发现在孕妇、新生儿的肠道中可较高比率地分离出加氏乳杆菌、发酵乳杆菌、类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、植物乳杆菌、唾液乳杆菌、卷曲乳杆菌等，但这些乳杆菌中，相对于除阴道分离率高的卷曲乳杆菌和加氏乳杆菌以外的乳杆菌，MIC显示出7％以上的高值。
这表明赤竹提取物对作为阴道内有益菌、消化道内有益菌的乳杆菌的抗菌能力，与被评价为具有更强病原性的细菌种相比，前者通常更弱。这预示着当打算同时在妇科阴道、消化道使用赤竹提取物时，这一点有可能成为对于本物质来说极其优异的特点。
表17赤竹提取物对乳杆菌群的抗菌作用


*接种菌量Mc Farland#1的1接种环量试验例12(对大肠杆菌、甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的抗菌作用)本发明人发现赤竹提取物对作为各种化脓性感染病原菌的极为重要的大肠杆菌、对各种抗菌药表现出多重耐药性的甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)、与MRSA一样对多种抗菌药具有很强耐药倾向的绿脓杆菌等具有抗菌作用。本发明人一直都是通过以改良GAM琼脂培养基作为敏感性测定培养基的琼脂平板稀释法测定赤竹提取物对厌氧菌的抗菌作用，其中所述改良GAM琼脂培养基是对厌氧菌而言受到推荐的培养基。
本试验例中，分别使用10株以上从患者分离得到的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌这些兼性菌和需氧菌，以对兼性菌而言受到推荐的Mueller Hinton Agar作为测定培养基，通过琼脂平板稀释法研究赤竹提取物对这些菌种的抗菌作用。
材料和方法所用菌株使用保存于设施中的临床分离株14株大肠杆菌、14株甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌和13株绿脓杆菌。另外，使用大肠杆菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923作为测定敏感性的精度控制用菌株。试验液与试验例7的一样。使用无菌蒸馏水稀释溶液。
抗菌试验按照抗菌药对兼性菌的抗菌能力测定法中所用的琼脂平板稀释法，测定最低抑菌浓度(MIC)。尽可能以日本化学疗法学会标准法为基准。制备含有赤竹提取物的Muellar Hinton琼脂平板(Difco)，使最终浓度为7、6、5、4、3、2、1、0.5、0.25、0.125、0.063、0.032％。对于7％-6％的高浓度区域，分别用14％-12％的赤竹提取液与2倍浓度的Mueller Hinton琼脂培养基以1∶1混合制作，对5％-0.032％的低浓度区域，将50％-0.32％的赤竹提取液与1倍浓度的MuellerHinton琼脂培养基以1∶9混合，制成含有赤竹提取物的琼脂培养基。用2N的NaOH水溶液将培养基调节至pH6.5-7.3。
另外，不用Mueller Hinton琼脂培养基，而用改良GAM琼脂培养基[日水制药]制备含有赤竹提取物的琼脂培养基，使用相同的接种菌液，接种大肠杆菌和MRSA，进行一晚厌氧性培养，求出MIC。此时也用2NNaOH将pH调节至6.7-7.3。
接种菌液的调整和判定在TSA琼脂培养基上培养24-48小时，将得到的受试菌株的菌落通过无菌棉棒取出，使其悬浮于Mueller Hinton肉汤(Difco)中，调整成浊度为Mc Farland No.1的菌液。将其10μL悬浮于1ml MuellerHinton肉汤中，将其5μl通过划线法接种于含有赤竹提取物的平板系列上。
在35℃有氧环境下培养20小时后，通过肉眼观察有没有生长。将厌氧培养后的平板在进行了一夜培养并判定后，再在大气环境下放置一夜，判定其有没有再增殖。
结果在调整了pH(pH6.5-7.3)的实验条件下测定的赤竹提取物对大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC)分布于2-3％，MIC50％为2％。对MRSA的MIC分布于0.25-0.5％，MIC50％为0.5％。对绿脓杆菌所有菌株的MIC为1％。
在本次用Mueller Hinton培养基进行的中性环境、需氧性培养的实验条件下，对精度控制用菌株大肠杆菌ATCC25922的MIC为2％，对金黄色葡萄球菌ATCC25923的MIC为0.5％。
用改良GAM琼脂培养基，在厌氧性环境下测定的赤竹提取物对14株大肠杆菌临床分离株的MIC50％为8％，对14株金黄色葡萄球菌临床分离株的MIC50％为3％。对于精度控制用菌株而言，在用改良GAM琼脂培养基的中性环境、厌氧性环境中对大肠杆菌ATCC25922的MIC为8％，对金黄色葡萄球菌ATCC25923为3％。
考察本试验例中，从通过尽可能接近日本化学疗法学会MIC测定标准法的赤竹提取物的MIC测定结果，可确认赤竹提取物对MRSA、绿脓杆菌，在大致为中性的环境中都显示出1％以下的MIC，具有极强的抗菌作用。
我们知道，有些药物对细菌的MIC随测定所用培养基的成分、pH、有无血液等添加物、接种菌量、培养环境等各种实验条件而变化。本发明人以破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、疮疱丙酸杆菌、脆弱拟杆菌等为对象研究了赤竹提取物的MIC，这些细菌都是在营养学上需要复杂的成分且只在不存在游离氧的厌氧性环境下才生长的厌氧菌。进行这些测定时，使用大肠杆菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923作为精度控制用菌株，但未曾将赤竹提取物对这些精度控制用菌株在厌氧性环境下的MIC与在通常用于兼性菌的测定环境下的MIC同时进行比较。这次对这一点进行了探讨，明确了其差别。以改良GMI琼脂培养基作为敏感性测定培养基的基础培养基，在厌氧性环境下测定的赤竹提取物的MIC，对大肠杆菌ATCC25922为7％以上，与用Mueller Hinton培养基进行需氧培养下测得的2％相比，可观察到向耐药性一侧的大幅移动。并且，对于金黄色葡萄球菌ATCC25923也是如此，在厌氧性环境下测定的赤竹提取物的MIC为3％，与用Mueller Hinton培养基进行需氧培养下测定的0.5％相比，可见到向耐药性侧的大幅移动。赤竹提取物在与厌氧菌一样的测定环境下测得的对14株MRSA的MIC90％为3％。厌氧培养下的金黄色葡萄球菌由于形成抑制生长的露滴状菌落，因而有时难以判定其增殖终点。将已判定过的平板再在有氧环境下放置一夜，确认露滴状菌落是否发生再增殖时，有3例中，判定为生长阳性的点经过一夜培养后未见其再增殖，所以测定赤竹提取物在厌氧性培养下的抗菌能力时，如果将金黄色葡萄球菌ATCC25923用于精度控制，并见到露滴状菌落，则需要先确认有没有再增殖能力等，对MIC的确定方法有必要进行重新考虑。由上述可知，在与厌氧菌相同的条件下测定的兼性菌的MIC向耐药性侧移动了6-8倍。其原因是由于MullerHinton琼脂与改良GAM琼脂的培养基成分不同，还是由于通过抗菌药氨基葡糖苷所见到的厌氧培养与需氧培养的不同，这是引起人们的兴趣之处，但对使用Mueller Hinton琼脂的需氧培养和厌氧培养的MIC进行比较研究得知，大肠杆菌ATCC25922在用Mueller Hinton琼脂进行的厌氧培养下的MIC与需氧培养下的,MIC相同，而金黄色葡萄球菌ATCC25923尽管与大肠杆菌ATCC25922的实验条件一样，其厌氧培养下的MIC却比需氧培养下的MIC高4倍等随菌种不同而不同的现象。这一现象可能是各种因素结合并相互作用所致。
表18赤竹提取物对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌的MIC分布

*需氧性Mueller Hinton琼脂、需要性培养厌氧性改良GAM琼脂培养基、厌氧性培养绿脓杆菌的厌氧性培养未实施参考表19以Muller Hinton Agar作为敏感性测定培养基、按照日本化学疗法学会标准法测定的赤竹提取物对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌3株参考菌株的MIC的比较

高10μl的Mc Farland No.1，低10μl的Mc Farland No.1的100倍稀释液，(1)在厌氧培养下不能测定，但再继续进行需氧培养后，判定为1％，NT未实施实验表20培养基pH对MIC的影响


表21改良GAM琼脂培养基、厌氧性培养、培养24小时

改良GAM琼脂培养基、需氧性培养、培养24小时试验例13(对细菌性阴道病关连微生物的抗菌作用)1.关于二路普雷沃氏菌和有色普雷沃氏菌株在分类为BV相关细菌的细菌中，首先研究赤竹提取物对二路普雷沃氏菌和有色普雷沃氏菌的抗菌作用。
所用菌株使用总共14株二路普雷沃氏菌和9株有色普雷沃氏菌(中间普雷沃氏菌(Prevotella intermedia)、产黑素普雷沃氏菌(Prevotella melaninogenica))。二路普雷沃氏菌是二十世纪90年代前期从女性阴道内分离得到并保存于所述设施的菌株，有色普雷沃氏菌是2002年从各种临床材料中分离得到并保存于所述设施的菌株。使用大肠杆菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923作为MIC精度控制用菌株。试验液与试验例7的一样。是浓度为50(w/v)％的酸性(pH5.0左右)溶液。使用无菌蒸馏水进行稀释。
抗菌试验按照抗菌药的抗菌能力测定法中所用的琼脂平板稀释法测定最低抑菌浓度。制备含有赤竹提取物的改良GAM琼脂平板(日水制药)，使终浓度为4、3、2、1、0.5、0.25、0.125％。将赤竹提取液与琼脂培养基以1∶9混合，制成含有预定浓度的赤竹提取物的琼脂培养基。用2N的NaOH水溶液调节培养基的pH(pH7.0-7.3)。
使用通过布鲁氏菌HK血液琼脂培养基(极东制药)培养48小时后得到的受试菌株的菌落，将其悬浮于厌氧菌肉汤MIC(Difco)中，调整成浊度为Mc Farland#1的菌液，10倍稀释后，将其1接种环的量(10μl)通过划线法接种于含有赤竹提取物的平板系列上。在本实验条件下，1接种环含有约104个细菌。在厌氧工作站(グンゼ产业)中于35℃培养2天后，通过肉眼观察有没有生长。确认有生长时，判定为(+)。
在本实验条件下测定的赤竹提取物对大肠杆菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923的MIC都是＞5％。
结果赤竹提取物在0.5％时完全抑制二路普雷沃氏菌的生长，在1％时完全抑制有色普雷沃氏菌的生长。赤竹提取物对14株二路普雷沃氏菌的MIC50％和对有色普雷沃氏菌的MIC50％都为0.5％。
表22赤竹提取物对14株二路普雷沃氏菌和9株有色普雷沃氏菌的抗菌作用


考察健康女性的阴道是厌氧菌和需氧菌的宝库。在女性产道的正常细菌群中，对保持阴道内清洁度具有重要作用的乳杆菌以最优势存在。但是另一方面，已知作为条件致病病原体的厌氧消化链球菌等厌氧性革兰氏阳性球菌和普雷沃氏菌(产黑素普雷沃氏菌、中间普雷沃氏菌等)、拟杆菌等厌氧性革兰氏阴性杆菌也以低菌量存在，并在被称为细菌性阴道病的状况下异常地增殖，所以将它们称为细菌性阴道病关连微生物。细菌性阴道病是产生乳样具有恶臭的白带的疾病，当前正在探讨这种疾病与STD易感染性、早产、早期破水等见于围产期的各种异常的关系以及与盆腔炎性疾病PID发展的关系。
已知二路普雷沃氏菌和有色普雷沃氏菌在细菌性阴道病关连微生物中，也是与重症度或顽固性相关的极重要的细菌种。
从这次的研究可知赤竹提取物对这些二路普雷沃氏菌和有色普雷沃氏菌具有极好的抗菌作用。
表23妇产科领域感染的病原菌一览(疾病名、学名、俗名)


*厌氧菌试验例14(对细菌性阴道病关连微生物的抗菌作用)2.关于阴道加德纳氏菌从健康女性的阴道可检测出阴道加德纳氏菌，但其数量很少。阴道加德纳氏菌与人型支原体、厌氧消化链球菌、有色普雷沃氏菌、非有色普雷沃氏菌、卟啉单胞菌等一起都属于在细菌性阴道病的状态下异常增殖的所谓BV关连微生物中的一种细菌。并且作为产道感染的病原菌是极为重要的。本试验对阴道加德纳氏菌进行探讨。
材料与方法所用菌株使用了总共11株阴道加德纳氏菌。这包括购自NCTC或ATCC的2株菌株和9株临床分离株。临床分离株是本发明人在二十世纪九十年代前期从女性阴道内分离得到并保存于所述设施的菌株。还使用大肠杆菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923作为MIC精度控制用菌株。试验液与试验例7的一样。
抗菌试验按照抗菌药的抗菌能力测定法中所用的琼脂平板稀释法测定最低抑菌浓度(MIC)。以日本化学疗法学会标准法为基准。制备含有赤竹提取物的布鲁氏菌HK血液琼脂培养基(极东制药)，使终浓度为8、7、6、5、4、3、2、1、0.5、0.25、0.125％。将赤竹提取液与布鲁氏菌HK血液琼脂培养基以1∶1或1∶9的比例混合，制成含有预定浓度的赤竹提取物的琼脂培养基。并用2N NaOH水溶液调整培养基的pH(pH7.0-7.3)。
使用通过布鲁氏菌HK血液琼脂培养基(极东制药)培养48小时后得到的受试菌株的菌落，使其悬浮于厌氧菌肉汤MIC(Difco)中，调整成浊度为Mc Farland No.1的菌液。将其1接种环量(10μl)通过划线法接种于含有赤竹提取物的平板系列上。对对照培养基进行适当设定，使通过对照培养基进行的生长在涂抹部位整体看起来都一样。
在厌氧工作站(グンゼ产业)中于35℃培养2天后，通过肉眼观察有没有生长。确认有生长时，判定为(+)。
在本实验条件下测得的赤竹提取物对大肠杆菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923的MIC分别为＞8％、8％。
结果赤竹提取物对11株阴道加德纳氏菌的MIC范围分布于6％-4％，MIC50％为6％。
表24赤竹提取物对11株阴道加德纳氏菌的抗菌作用


考察由本次的研究可知，赤竹提取物对作为细菌性阴道病关连微生物中的一种重要细菌的兼性厌氧菌阴道加德纳氏菌，以6％的浓度即可完全抑制其生长。知悉其与作为BV关连微生物的厌氧菌的为非有色普雷沃氏菌的二路普雷沃氏菌或者为有色普雷沃氏菌的产黑素普雷沃氏菌相比，对前者的抗菌能力更弱。已知本提取物即使以8％的浓度也不会抑制乳杆菌的多数菌株的生长，所以认为在用于生物体时的浓度设定方面取得了重要成绩。
在一系列的研究中，知悉作为参考菌株的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC随实验条件而有所变化。MIC受所用敏感性测定用培养基的种类、接种菌量、培养条件等因素影响，这回首次使用了布鲁氏菌HK血液琼脂培养基作为敏感性测定培养基。用本培养基测定的MIC比用改良GAM培养基测定的MIC似乎向酸性侧有所移动。
试验例15(对细菌性阴道病关连微生物的抗菌作用)3.关于Finegoldia、Micromonas、消化链球菌属厌氧球菌Finegoldia magna、Micromonas micros、消化链球菌与二路普雷沃氏菌、有色普雷沃氏菌、卟啉单胞菌、生殖道支原体(人型支原体)、阴道加德纳氏菌等一起，都是在以阴道内乳酸菌减少、阴道内pH降低和乳样且具有恶臭(胺臭)的白带为特征细菌性阴道病(BV)状态下异常增加的细菌性阴道病关连微生物的成员。本试验例中，研究赤竹提取物对被分类为细菌性阴道病关连细菌的一种细菌—厌氧球菌的抗菌作用。
材料与方法所用菌株使用了5株厌氧消化链球菌、3株不解糖消化链球菌(Peptostreptococcus asaccharolyticus)、7株Finegoldia magna、6株Micromonas micros总共21株。还使用大肠杆菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923作为MIC精度控制用菌株。试验液与试验例7的一样。
抗菌试验按照抗菌药的抗菌能力测定法中所用的琼脂平板稀释法，测定最低抑菌浓度。制备含有赤竹提取物的改良GAM琼脂平板(日水制药)，使终浓度为5、4、3、2、1、0.5、0.25、0.125％。将赤竹提取液与琼脂培养基以1∶9混合，制成含有预定浓度的赤竹提取物的琼脂培养基。并用2N NaOH水溶液调整培养基的pH(pH7.0-7.3)。
使用通过布鲁氏菌HK血液琼脂培养基(极东制药)培养48小时后得到的受试菌株的菌落，使其悬浮于厌氧菌肉汤MIC(Difco)中，调整成浊度为Mc Farland#1的菌液。将其1接种环量(10μl)通过划线法接种于含有赤竹提取物的平板系列上。在本实验条件下，1接种环含有约106个细菌。
在厌氧工作站(グンゼ产业)中于35℃培养24小时后，通过肉眼观察有没有生长。确认有生长时，判定为(+)。
在本实验条件下测得的赤竹提取物对大肠杆菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923的MIC都为＞＝5％。
结果赤竹提取物以3％的浓度即完全抑制了Micromonas micros、Finegoldia magna、厌氧消化链球菌、不解糖消化链球菌这21株厌氧球菌的生长。赤竹提取物对厌氧球菌的MIC50％为0.5％。
表25赤竹提取物对厌氧球菌的抗菌作用

考察细菌性阴道病是产生乳样具有恶臭的白带的疾病，涉及到与对性感染(STD)的易感染性、早产、早期破水等见于围产期的各种异常的关系以及与骨盆内炎性疾病PID发展的关系。已知细菌性阴道病中，健康时对保持阴道内清洁度具有重要作用的乳杆菌显著减少，普雷沃氏菌(产黑素普雷沃氏菌、中间普雷沃氏菌等)、拟杆菌等厌氧性革兰氏阴性杆菌和厌氧消化链球菌等厌氧性革兰氏阳性球菌以及阴道加德纳氏菌、支原体等微生物异常增殖。这些细菌群被称为细菌性阴道病关连微生物。
先前已说明赤竹提取物以2％的低浓度即可抑制细菌性阴道病关连微生物普雷沃氏菌(二路普雷沃氏菌、产黑素普雷沃氏菌、中间普雷沃氏菌等)的生长，以6％的浓度可抑制脆弱拟杆菌群、阴道加德纳氏菌的生长。由本次的研究可知，赤竹提取物以2％的浓度即可抑制厌氧性球菌群所有菌株的生长。
试验例16(对细菌性阴道病关连微生物的抗菌作用)关于动弯杆菌作为厌氧性革兰氏阳性杆菌的动弯杆菌是厌氧性无芽孢革兰氏阳性厌氧杆菌，与二路普雷沃氏菌、有色普雷沃氏菌、卟啉单胞菌、生殖道支原体(人型支原体)、阴道加德纳氏菌一起，都是在以阴道内乳酸菌减少、阴道内pH降低和乳样且具有恶臭(胺臭)的白带为特征的细菌性阴道病状态下异常增加的细菌性阴道病关连微生物的成员。本试验例中，研究赤竹提取物对动弯杆菌的抗菌作用。
材料与方法所用菌株使用了12株动弯杆菌。其中包括柯氏动弯杆菌柯氏亚种(Mobiluncus curtisii subsp.curtisii)ATCC35242、柯氏动弯杆菌霍氏亚种(Mobiluncus curtisii subsp.holmessii)ATCC25241、羞怯动弯杆菌(Mobiluncus mullielis)ATCC35240、ATCC35243。另外用金黄色葡萄球菌ATCC25923作为MIC精度控制用菌株。试验液与试验例7的一样。
抗菌试验按照抗菌药的抗菌能力测定法中所用的琼脂平板稀释法，测定最低抑菌浓度。制备含有赤竹提取物的布鲁氏菌HK血液琼脂平板，使终浓度为8、7、6、5、4、3、2、1、0.5、0.25、0.125％。血液使用因冷冻溶解而溶血的羊脱纤维血(日生材)，以5％的比例添加到培养基中。将赤竹提取液与琼脂培养基以1∶1混合，制成含有预定浓度的赤竹提取物的琼脂培养基。并用2N NaOH水溶液调整培养基的pH(pH7.0±0.3)。
使用通过布鲁氏菌HK血液琼脂培养基(极东制药)培养72小时后得到的受试菌株的菌落，使其悬浮于厌氧菌肉汤MIC(Difco)中，调整成浊度为Mc Farland#1的菌液。将其1接种环量(10μl)通过划线法接种于含有赤竹提取物的平板系列上。在本实验条件下，1接种环含有约106个细菌。
在厌氧工作站(グンゼ产业)中于35℃培养2天后，通过肉眼观察有没有生长。确认有生长时，判定为(+)。
在pH7.0的本实验条件下测得的赤竹提取物对金黄色葡萄球菌ATCC25923的MIC为8％。(与用对照培养基进行的生长相比，观察到显著抑制生长的浓度为4％。)结果结果显示于表26中。赤竹提取物在4％时可完全抑制动弯杆菌的生长。赤竹提取物对动弯杆菌的MIC50％为4％。
考察细菌性阴道病是产生乳样具有恶臭的白带的疾病，涉及与对STD的易感染性、早产、早期破水等见于围产期的各种异常的关系以及与骨盆内炎症性疾病PID发展的关系。已知细菌性阴道病中，健康时对保持阴道内清洁度具有重要作用的乳杆菌显著减少，普雷沃氏菌(产黑素普雷沃氏菌、中间普雷沃氏菌等)、拟杆菌等厌氧性革兰氏阴性杆菌和作为厌氧性革兰氏阳杆菌的动弯杆菌、厌氧消化链球菌等厌氧性革兰氏阳性球菌以及阴道加德纳氏菌、支原体等微生物异常增殖。这些细菌群被称为细菌性阴道病关连微生物。在细菌性阴道病关连微生物中，动弯杆菌是在BV评分值高的状态下则检出率增高的菌种，这在本发明人的研究中也得到确认。
先前已说明赤竹提取物以2％的低浓度即可抑制细菌性阴道病关连微生物普雷沃氏菌(二路普雷沃氏菌、产黑素普雷沃氏菌、中间普雷沃氏菌等)的生长，以6％的浓度可抑制脆弱拟杆菌群、阴道加德纳氏菌的生长，并且以2％的浓度可抑制厌氧球菌群所有菌株的生长。本试验例对动弯杆菌进行探讨。其结果可知赤竹提取物以4％的浓度即可抑制它们的生长。
表26赤竹提取物对动弯杆菌的抗菌作用

试验例17(赤竹提取物对脆弱拟杆菌菌株的抗菌作用)脆弱拟杆菌是从人粪便中分离出的无芽孢厌氧性革兰氏阴性杆菌，在包括褥疮、肛周脓肿等在内的各种皮肤、皮下软组织感染中，与金黄色葡萄球菌(MRSA)、多重耐药性绿脓杆菌都是临床上极其重要的菌种。本试验例研究赤竹提取物对脆弱拟杆菌的抗菌作用。
所用菌株使用了总共12株脆弱拟杆菌。这些临床分离株是在2002年1月至7月从各种化脓性感染患者分离得到并保存于所述设施的菌株。并用大肠杆菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923作为MIC精度控制用菌株。试验液与试验例7的一样。
抗菌试验按照抗菌药的抗菌能力测定法中所用的琼脂平板稀释法测定最低抑菌浓度。以日本化学疗法学会标准法为基准。制备含有赤竹提取物的改良GAM琼脂平板(日水制药)，使终浓度为10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％。10-6％用赤竹提取液与2倍琼脂培养基以1∶1混合，5-1％用赤竹提取液与琼脂培养基以1∶9混合，制成含有预定浓度的赤竹提取物的琼脂培养基。并用2N NaOH水溶液调整培养基的pH(pH6.6-7.1)。
使用通过布鲁氏菌HK血液琼脂培养基(极东制药)培养48小时后得到的受试菌株的菌落，使其悬浮于厌氧菌肉汤MIC(Difco)中，调整成浊度为Mc Farland#1的菌液，将其1接种环量(10μl)通过划线法接种于含有赤竹提取物的平板系列上。在本实验条件下，1接种环包括约106cfu/ml的细菌数。
在厌氧工作站(グンゼ产业)中于35℃培养1、2天后，通过肉眼观察有没有生长。确认有生长时，判定为(+)。
在本实验条件下测得的赤竹提取物对大肠杆菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923的MIC都为6％。
结果赤竹提取物对12林脆弱拟杆菌的MIC范围分布于4-6％，MIC90％为5％。
表27赤竹提取物对12株脆弱拟杆菌的抗菌作用


考察脆弱拟杆菌群(特别是脆弱拟杆菌)是厌氧性无芽孢革兰氏阴性厌氧杆菌，存在于人的下部消化道粘膜上。该菌群在粘膜出现破绽时，通常侵入无菌的组织或内脏，引起感染。是可从各种脓性感染，特别是横膈膜以下的脓性感染以最高频率分离得到的厌氧菌。本细菌与大肠杆菌等兼性杆菌、葡萄球菌、肠球菌、米氏链球菌(Streptococcus milleri)群等兼性、微需氧球菌、拟杆菌以外的无芽孢厌氧菌等一起存在于感染部位。也就是说作为多种菌感染的构成菌是很重要的。脆弱拟杆菌与其它的部分兼性菌一样，对很多的抗菌药具有自然耐药性，对本菌种具有抗菌能力的抗菌药比较限于氯洁霉素、头霉素、卡巴培南等。但是，对这数量很少的几种抗菌药，也还存在容易获得耐药性的问题。因此，对于与脆弱拟杆菌相关的感染的治疗，需长期使用更广谱的抗菌药或者多种抗菌药。但通过这些使用方法，不用说本菌种，具有使本菌种以外的细菌种的抗菌药耐药性增长的可能，可以说本菌种在感染治疗上是极难对付的菌种。
由本次的研究可知，作为脓性多种菌感染病原菌，与金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌一起都是重要的无芽孢厌氧菌的代表性菌群脆弱拟杆菌群的细菌种，赤竹提取物对其具有与对厌氧条件下的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌参考菌株的作用至少同等程度的抗菌作用。
试验例18(盆腔内感染)
健康女性的阴道是厌氧菌和需氧菌的一个宝库。在女性产道的正常细菌群中，厌氧菌以需氧菌10倍以上的量大量存在。是厌氧性革兰氏阳性球菌和拟杆菌(按照现在的分类是普雷沃氏菌和拟杆菌)。厌氧菌可从与STD病原体没有关系的产道感染的大部分患者分离得到。主要的厌氧性病原体是脆弱拟杆菌、二路普雷沃氏菌、解糖胨普雷沃氏菌(Prevotella disiens)、产黑素普雷沃氏菌、厌氧球菌以及梭菌。厌氧菌与输卵管卵巢脓肿、脓毒性流产、盆腔内脓肿、子宫内膜炎、术后创部感染，特别是剖腹产术后创部感染等有关系。这些感染多是厌氧菌与肠杆菌科的细菌引起的多种菌感染，但仅由肠杆菌科的细菌与未分离出其它兼性菌的厌氧菌引起的感染比腹腔内感染的情况更多见。其特征是从子宫排出具有恶臭的脓液或血液、包覆有子宫的下腹部全体或盆腔内局部压痛、持续发热或畏寒。有时并发盆腔静脉的化脓性血栓性静脉炎，成为引起反复性脓毒性肺栓塞的病因。
厌氧菌可能是与细菌性阴道病的病因相关的因素。至今原因不明的症候群具有下述特征具有恶臭的分泌物异常多和阴道内的阴道加德纳氏菌、普雷沃氏菌、动弯杆菌、消化链球菌以及支原体等细菌的异常增加。厌氧菌被认为在盆腔炎性疾病(PID)的病因方面扮演着重要角色，多名专家都阐述了细菌性阴道病与PID的发展之间的关系。
以放线菌(Actinomyces spp.)为病因的盆腔感染是与子宫内避孕用具的使用相关联的感染。
试验例19(赤竹提取物对双歧杆菌(Bifidobacterium spp.)的抗菌作用)评价具有抗菌能力的物质时，在弄清其对人体病原菌的作用的同时，弄清其对存在于皮肤、粘膜上的益生菌或条件致病菌的作用是极为重要的。
双歧杆菌与乳杆菌一样，是消化道内、阴道内的固有细菌，是除已知具有呼吸器官病原性的齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)外，没有被指出具有病原性的菌种的益生菌。因此，用双歧杆菌的参考菌株，对赤竹提取物对双歧杆菌具有何种程度的抗菌作用进行探讨。
材料和方法所用菌株使用表28中给出的机构保存的参考菌株。这些菌株是从JCM购买、保存于所述设施的菌株。从可在妇科领域感染和消化器官感染中以最高频率分离出的厌氧菌菌种中选取二路普雷沃氏菌ATCC29303、不解糖卟啉单胞菌ATCC25260、脆弱拟杆菌N-1作为对照。并出于同样的目的，将大肠杆菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923用作敏感性测定精度控制用菌株。试验液与试验例7的一样。用无菌蒸馏水稀释溶液。
抗菌试验按照抗菌药的抗菌能力测定法中所用的琼脂平板稀释法测定最低抑菌浓度(MIC)。以日本化学疗法学会标准法为基准。制备含有赤竹提取物的改良GAM琼脂平板(日水制药)，使终浓度为9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5％。10-6％的高浓度域分别用20-12％的赤竹提取液与2倍琼脂培养基以1∶1混合(最终pH5.3-5.5)，5-0.5％的低浓度区域用50-5％的赤竹提取液与1倍琼脂培养基以1∶9混合(最终pH5.5-6.0)，制成含有赤竹提取物的琼脂培养基。
接种菌液的调整在布鲁氏菌HK血液琼脂培养基种培养48小时，将得到的受试菌株的菌落用无菌棉棒取出，使其悬浮于厌氧菌肉汤(Difco)中，调整成浊度为Mc Farland No.1的菌液。将其10μl(接种量106cfu)通过划线法接种于含有赤竹提取物的平板系列上。对于对照菌株，用TSA琼脂培养基上的菌落，在厌氧菌肉汤中调整成Mc Farland#1的浊度，将其10μl(接种量106cfu)通过划线法进行接种。并在厌氧工作站(グンゼ产业)中于35℃培养18小时后，通过肉眼观察有没有生长。确认有生长时，判定为(+)。
结果在没有调整pH的酸性(pH5.3-6.0)实验条件下测定的赤竹提取物的最低抑菌浓度如表28所示。对于双歧杆菌的5菌种5株，除1株MIC为4％的双歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)外，最低抑菌浓度全部都在7％以上。同时测定的二路普雷沃氏菌ATCC29303、不解糖卟啉单胞菌ATCC25260的最低抑菌浓度都是0.5％，通过本方法测定的对2株AHSS的精度控制用菌株、大肠杆菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923的最低抑菌浓度都为4％。
考察已知赤竹提取物在6.25％以下(大多为4％左右)的浓度可以抑制一些病原性细菌的生长。因认为除赤竹提取物对这些病原性细菌的抗菌能力外，积累其对非病原性细菌的抗菌能力的信息也是极其重要的，所以进行了本次的研究。
从机体防御考虑，在人的粘膜中，乳杆菌、双歧杆菌的多数都扮演着极为重要的角色。本发明人已经报道赤竹提取物对作为产生过氧化氢的乳杆菌的卷曲乳杆菌和加氏乳杆菌的抗菌作用的MIC为10％以上，而对同时实施的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等具有代表性的病原性兼性菌的MIC为4％，对二路普雷沃氏菌、不解糖卟啉单胞菌、脆弱拟杆菌等具有代表性的化脓性兼性菌的MIC为0.5-4％，前者与后两者相比，前者是极弱的。
这次，可知赤竹提取物对消化道内固有的双歧杆菌的5菌种5株，也与对乳杆菌一样，仅具有很弱的抗菌力。
这强烈表明赤竹提取物对阴道内益生菌、消化道内益生菌的抗菌力比对条件致病性病原菌的抗菌力相对较弱。
表28赤竹提取物对双歧杆菌群的抗菌作用

*接种菌量将1接种环量的浊度为Mc Farland#1的菌液划线1cm试验例20(对白色念珠菌和Candida glabrata的抗真菌作用)本试验例研究对作为“鹅口疮”、女性阴道炎、外阴炎的病原菌白色念珠菌和Candida glabrata的抗真菌作用。
所用菌株使用了总共13株白色念珠菌和Candida glabrata。这些菌株是在2002年从各种临床材料分离得到并保存于所述设施的菌株。使用大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923和绿脓杆菌ATCC27853作为MIC精度控制用菌株。试验液与试验例7的一样。使用无菌蒸馏水进行稀释。
抗菌试验按照抗菌药的抗菌能力测定法中所用的琼脂平板稀释法测定最低抑菌浓度。制备含有赤竹提取物的MH琼脂平板(Difco)，使终浓度为8、7、6、5、4、3、2、1％。将赤竹提取液与琼脂培养基以1∶9混合，制成含有预定浓度的赤竹提取物的琼脂培养基。并用2N NaOH水溶液或10％氯化氢水溶液调整培养基的pH(pH7.0左右与pH5.0左右的两种)。
使用通过マイコセル琼脂培养基(BD)培养48小时后得到的受试菌株的菌落，使其悬浮于MH肉汤(Difco)中，调整成浊度为McFarland#1的菌液，将其1接种环量(10μl)通过划线法接种于含有赤竹提取物的平板系列上。在本实验条件下，1接种环包括约106个细菌。
在35℃培养24小时后，通过肉眼观察有没有生长。确认有生长时，判定为(+)。
在本实验条件下测得的1天后赤竹提取物对大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923和绿脓杆菌ATCC27853的MIC，在pH7下分别为2、＜＝1、2％；在pH5下全都为＜＝1。在3天后、室温下的MIC，pH7条件下分别为3、＜＝1、3，pH5条件下分别为2、＜＝1、＜＝1。
结果表中给出了在pH5和pH7的环境下1天后和3天后判定的赤竹提取物对念珠菌的MIC分布。在pH5、24小时判定时，赤竹提取物以5％的浓度抑制了所有8株白色念珠菌和4株Candida glabrata的的生长。3天后判定时，抑制全部菌株的生长需要8％的浓度。
在pH7、24小时判定时，赤竹提取物以5％的浓度抑制了白色念珠菌所有菌株的生长。未能判定对Candida glabrata的MIC。3天后判定时，抑制包括Candida glabrata在内的全部菌株生长需要8％以上的浓度。
考察已知女性阴道炎有由原虫引起的毛滴虫阴道炎、由真菌引起的念珠菌性阴道炎和由细菌引起的细菌性阴道病(＝非特异性阴道炎)。引起阴道炎的念珠菌也是外阴炎的病因。念珠菌性阴道炎与其它阴道炎不同，以白带呈乳酪状为特征，是一种瘙痒感极强的疾病。通过给予抗真菌剂进行治疗。
本次研究确认了赤竹提取物具有抑制酵母状真菌生长的作用。在酸性条件下1天后测定的MIC分布于5％-3％。在调整pH后于中性条件下测定的MIC分布于5％-4％。但是，当进一步在室温下放置3天后再次判定MIC时，赤竹提取物对念珠菌的pH5.0下的MIC除1株为8％外，其余12株从5-3％的范围向7-4％范围的耐药性侧移动，在pH7.0下的MIC则13株全部都从5-4％的范围移动至8％以上了。这暗示着1天后确定的MIC或更高浓度的赤竹提取物对真菌所显示出的抗菌作用只是抑菌，杀菌则需要更高的浓度。将Candida glabrata在中性环境下于37℃培养1天后，未见到有充分的生长，但之后在室温下放置3天后，可确认充分生长，可以判定MIC。用调整成酸性的Mueller Hinton培养基，在37℃培养1天后，可见到充分的生长，可以判定MIC。
用Mueller Hinton培养基作为敏感性测定用培养基的本实验中，赤竹提取物对念珠菌的MIC为7-4％的浓度，显示出具有抗真菌作用。其MIC在中性环境下比酸性环境显示低1管左右的值。而且，即使采用在中性条件下1天后抑制了生长的相当高的浓度，其后通过在室温放置，仍可观察到念珠菌生长，由此可知其作用只是制菌作用。在酸性条件下，采用1天后抑制了生长的浓度，之后虽观察到了念珠菌生长，但其生长程度比在中性环境下观察到的生长程度轻。即，本提取物在酸性条件下对念珠菌比在中性环境下显示出更强的杀菌作用。在将赤竹提取物进行临床应用的情况下，设定浓度时，除考虑与本提取物的毒性相关的信息外，还需要充分考虑这一点后，再设定使用浓度和使用次数。
由上述内容可知，除抗菌作用外还具有抗真菌作用的赤竹提取物，足可作为念珠菌阴道炎和外阴炎以及其它与念珠菌有关的病状的治疗药物使用。
本发明人确认了本提取物对普雷沃氏菌、阴道加德纳氏菌等与细菌性阴道病有关的细菌显示强或中等程度的抗菌作用以及具有其它细菌学上的特性，由此认为其作为细菌性阴道病的治疗药物的有用性很高，这种情况下很容易想到，同时拥有抗真菌作用的本提取物具备一种特性，即可防止念珠菌引起的菌交替现象或交替症的发生，而据报道，这是目前用于细菌性阴道病的氯霉素等完全没有抗真菌作用的抗菌药用后产生的副作用。
表29赤竹提取物对白色念珠菌和Candida glaburata的抗菌作用

*培养基pH**判定天数
*在不含赤竹提取物的培养基(pH7.0)上生长差，因而保留判定试验例21(对来自于寻常痤疮患者病灶的葡萄球菌的抗菌作用)6.25％浓度的赤竹提取物可完全抑制作为粉刺(寻常痤疮)的重要病因之一的疮疱丙酸杆菌的生长。并且已知，赤竹提取物以1％以下的浓度可完全抑制重要的化脓性球菌金黄色葡萄球菌(MRSA)的生长。本发明人使用13株从粉刺患者病灶分离出的粉刺的重要加重因子表皮葡萄球菌和1株科氏葡萄球菌，总共14株葡萄球菌，通过琼脂平板稀释法研究赤竹提取物的抗菌作用。
材料与方法所用菌株使用了13株表皮葡萄球菌和1株科氏葡萄球菌，总共14株。使用大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923作为敏感性测定的精度控制用菌株。表30中给出了所用菌株的菌种与抗菌药敏感性。
表30来自于粉刺病灶的葡萄球菌的对抗菌药的耐药性


试验液与试验例7的一样。使用无菌蒸馏水稀释溶液。
抗菌试验按照抗菌药对兼性菌的抗菌能力测定法中所用的琼脂平板稀释法测定最低抑菌浓度(MIC)。尽可能以日本化学疗法学会标准法为基准。制备含有赤竹提取物的Muellar Hinton琼脂平板(Difco)，使终浓度为5、4、3、2、1、0.5、0.25、0.125％。将50-1.25％的赤竹提取液与1倍浓度的Mueller Hinton琼脂培养基以1∶9混合，制成含有赤竹提取物的琼脂培养基。用2N NaOH水溶液将培养基调节至pH6.1-7.1。对金黄色葡萄球菌ATC25922和大肠杆菌ATCC25922的MIC为2％。
接种菌液的调整与判定在TSA琼脂培养基培养24-48小时，将得到的受试菌株的菌落用无菌棉棒取出，使其悬浮于Mueller Hinton肉汤(Difco)中，调整成浊度为Mc Farland No.1的菌液。将其10μl悬浮于1ml MuellerHinton肉汤中，将其10μl通过划线法接种于含有赤竹提取物的平板系列上。在35℃、有氧环境下培养20小时后，通过肉眼观察有没有生长。
结果使用13株表皮葡萄球菌和1株科氏葡萄球菌，总共14株，通过琼脂平板稀释法分析赤竹提取物的抗菌作用。其结果，赤竹提取物在1％浓度时完全抑制了这些菌株的生长。对14株菌株进行对三种抗菌药(四环素、氯洁霉素、氧氟沙星)的敏感性试验，对四环素1种抗菌药具有耐药性的菌株有2株，对氯洁霉素1种抗菌药具有耐药性的菌株有1株，对四环素和氯洁霉素2种抗菌药具有耐药性的菌株有2株，对氧氟沙星1种抗菌药具有耐药性的菌株有1株，但赤竹提取物对这些耐药菌，同样以1％以下的浓度即可抑制其生长。
表31赤竹提取物对14株葡萄球菌的抗菌作用

考察本发明人通过琼脂平板稀释法，分析了从粉刺患者分离得到的作为粉刺加重因子而重要的13株表皮葡萄球菌和1株科氏葡萄球菌总共14株对赤竹提取物的敏感性。其结果，赤竹提取物以2％的浓度完全抑制了这些菌株的生长。进行了对三种抗菌药(四环素、氯洁霉素、氧氟沙星)的敏感性试验的14株菌株中，对四环素1种抗菌药具有耐药性的菌株有2株，对氯洁霉素1种抗菌药具有耐药性的菌株有1株，对四环素和氯洁霉素2种抗菌药具有耐药性的菌株有2株，对氧氟沙星1种抗菌药具有耐药性的菌株有1株，但赤竹提取物对这些耐药菌，同样以2％以下的浓度即可抑制其生长。
以上事实证明若赤竹提取物的浓度为可抑制疮疱丙酸杆菌生长的6.25％，则对加重因子葡萄球菌也具有充分的作用，作为粉刺的治疗药是极为有用的。
试验例22(对来自于寻常痤疮患者病灶的葡萄球菌的抗菌作用)本试验例使用从粉刺患者病灶分离出的总共44株表皮葡萄球菌，通过琼脂平板稀释法分析赤竹提取物的抗菌作用。
所用菌株使用了总共44株葡萄球菌。并使用大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923作为敏感性测定的精度控制用菌株。试验液与试验例7的一样。使用无菌蒸馏水进行溶液的稀释。
抗菌试验按照抗菌药对兼性菌的抗菌能力测定法中所用的琼脂平板稀释法测定最低抑菌浓度(MIC)。尽可能以日本化学疗法学会标准法为基准。制备含有赤竹提取物的Muellar Hinton琼脂平板(Difco)，使终浓度为5、4、3、2、1、0.5、0.25、0.125％。用2N NaOH水溶液将培养基调节至pH6.1-7.1。对金黄色葡萄球菌ATC25922和大肠杆菌ATCC25922的MIC为2％。
接种菌液的调整与判定在TSA琼脂培养基上培养24-48小时，将得到的受试菌株的菌落用无菌棉棒取出，使其悬浮于Mueller Hinton肉汤(Difco)中，调整成浊度为Mc Farland No.1的菌液。将其10μl悬浮于1ml MuellerHinton肉汤中，将其10μl通过划线法接种于含有赤竹提取物的平板系列上。在35℃、有氧环境下培养20小时后，通过肉眼观察有没有生长。
结果归纳在表32中。
表32葡萄球菌(44株)对赤竹提取物和各种抗菌药的敏感性


1)表皮平整球菌34株、头状葡萄球菌2株、金黄色葡萄球菌2株、科氏葡萄球菌1株、人葡萄球菌1株、溶血葡萄球菌1株、种名未定葡萄球菌(Staphylococcus sp.)3株。
试验例23(对阴道炎和细菌性阴道病关连微生物的抗菌作用)试验液与试验例7的一样。是50(w/v)％的棕褐、具有芳香、稍有粘性的酸性液体。
抗菌能力的试验法效仿抗菌药对厌氧菌的抗菌能力测定法，以改良GAM琼脂培养基或布鲁氏菌HK琼脂培养基为测定用基础培养基，求出最低抑菌浓度(MIC).
供试菌株念珠菌和二路普雷沃氏菌(14株)、有色普雷沃氏菌(9株)、Finegoldia、Micromonas、消化链球菌的厌氧球菌群(21株)、动弯杆菌(12株)、阴道加德纳氏菌(11株)。
成绩与总结已知赤竹提取物对BV关连微生物中的兼性厌氧菌和厌氧菌以及念珠菌的抗菌能力的程度。抑制念珠菌生长的浓度为3-5％，抑制阴道加德纳氏菌生长的浓度为6％，抑制动弯杆菌生长的浓度为4％，阻止厌氧球菌群生长的浓度为3％，阻止普雷沃氏菌生长的浓度为1％。
试验例24(赤竹提取物对专性厌氧菌的抗菌谱)使用厌氧菌参考菌株在pH6.0和pH7.0条件下的分析本试验例中，为明确赤竹提取物的抗菌谱，使用多株包括一部分难处理的微需氧菌、兼性菌(链球菌、乳杆菌、放线菌、Sutterella)在内的教室保存的专性厌氧菌，在中性(pH7.0)和弱酸性(pH6.0)附近，研究赤竹提取物的抗菌作用。
所用菌株使用保存于所述设施的参考菌株[表33-36]。用大肠杆菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923作为MIC精度控制用菌株。试验液与试验例7的一样。使用无菌蒸馏水进行稀释。
抗菌试验按照抗菌药的抗菌能力测定法中所用的琼脂平板稀释法，测定最低抑菌浓度。制作含有赤竹提取物的改良GAM琼脂平板(日水制药)，使终浓度为6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1％。用2N氢氧化钠水溶液和10％盐酸水溶液调整培养基的pH，其目标为pH6.0和pH7.0。
使用通过布鲁氏菌HK血液琼脂培养基(极东制药)培养48小时后得到的受试菌株的菌落，使其悬浮于厌氧菌肉汤MIC(Difco)中，调整成浊度为Mc Farland#1的菌液，10倍稀释后，将其1接种环量通过划线法接种于含有赤竹提取物的平板系列上。本实验条件下，1接种环含有约104个细菌。
在厌氧工作站(グンゼ产业)中于35℃培养2天后(梭菌则是培养1天后)，通过肉眼观察有没有生长。确认有生长时，判定为(+)。结果如表33-36所示。
表33 1)对厌氧球菌(消化链球菌、葡萄球菌、Finegoldia、Micromonas、阿托波氏菌、孪生球菌)和微需氧菌(链球菌)以及厌氧性革兰氏阳性杆菌(放线菌、真杆菌(Eubacterium)、丙酸杆菌、双歧杆菌)的抗菌能力



接种菌量108/ml培养时间48小时后判定备注厌氧消化链球菌ATCC27337、不解糖消化链球菌WAL3218、产吲哚消化链球菌GAI0915、普氏消化链球菌ATCC9321、Micromonasmicros VPI-5464-1、Finegoldia magna ATCC29328、解糖葡萄球菌ATCC14953、极小阿托波氏菌VPI0546、双歧双歧杆菌JCM1255在pH6.0不生长。
表34对乳酸杆菌(乳杆菌)和厌氧革兰氏阴性杆菌(拟杆菌)的抗菌作用


接种菌量107/ml培养时间35℃48小时后判定表35对厌氧性革兰氏阴性杆菌(拟杆菌、普雷沃氏菌、卟啉单胞菌、梭杆菌、嗜胆菌、脱硫弧菌)、微需氧菌(弯曲杆菌、Sutterella、二氧化碳嗜纤维菌)和厌氧性革兰氏阴性球菌(韦荣氏球菌)的抗菌作用


接种菌量107/ml 培养时间35℃48小时备注
解肝素普雷沃氏菌ATCC35895、解糖卟啉单胞菌ATCC25260、牙龈卟啉单胞菌ATCC33277、沃氏嗜胆菌WAL7959、piger脱硫弧菌DSM749用pH6.0的不含提取物的对照培养基进行培养时，不生长。
表36对有芽孢厌氧菌(梭菌)的抗菌力

*败毒梭菌、索氏梭菌、产气荚膜梭菌属于气性坏疽菌群的成员。
接种菌量107/ml培养35℃24小时后判定总结至此弄清了赤竹提取物对厌氧菌群的抗菌谱的概要。若假定赤竹提取物的MIC为3％以下时为强抗菌能力，4％-6％时为中等程度的抗菌能力，7％以上时为弱抗菌能力，则可以如下进行描述。
赤竹提取物对无芽孢厌氧性革兰氏阳性球菌(Finegoldia、Micromonas、消化链球菌、阿托波氏菌、孪生球菌)具有强抗菌能力。但是，对微需氧菌的anginosus群具有弱抗菌能力。
无芽孢革兰氏阳性厌氧菌中，对丙酸杆菌具有中等程度的抗菌能力，对放线菌、双歧杆菌、乳杆菌具有弱抗菌能力。无芽孢厌氧性革兰氏阴性杆菌中，对普雷沃氏菌、卟啉单胞菌、嗜胆菌、脱硫弧菌、梭杆菌具有强抗菌作用，对拟杆菌、Sutterella具有中等程度的抗菌作用。对厌氧性革兰氏阳性球菌(韦荣氏球菌(Veillonella))具有强抗菌作用。梭菌中，除对索氏梭菌显示出中等程度的抗菌作用外，对其余的所有梭菌均显示出强抗菌作用。
产业实用性本发明的抗菌剂对破伤风杆菌、念珠菌(例如白色念珠菌、Candidaglabrata)、丙酸杆菌属细菌、气性坏疽菌、各种耐药菌(例如甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌)、阴道炎和细菌性阴道病关连微生物(例如Finegoldia、Micromonas、消化链球菌)等显示出强抗菌作用，对放线菌、双歧杆菌、乳杆菌显示出弱抗菌作用，并且对疱疹病毒等病毒显示出抗病毒作用，可用作抗菌性油墨、抗菌性涂料、抗菌性日本酒、抗菌性粘结剂、抗菌性饮料、抗菌性食品、抗菌性调味料、动植物用抗菌剂、防腐剂、农业杀菌剂、农药等。特别是除赤竹提取物外还含有有机酸(例如苹果酸)的本发明抗菌剂的抗菌作用特别显著。
权利要求
1.含有赤竹提取物的抗破伤风杆菌剂。
2.含有赤竹提取物的抗真菌剂。
3.权利要求2的抗真菌剂，该抗真菌剂还含有有机酸。
4.权利要求3的抗真菌剂，其中所述真菌为念珠菌。
5.含有赤竹提取物的抗病毒剂。
6.含有赤竹单宁酸的抗菌剂。
7.权利要求6的抗菌剂，该抗菌剂是抗金黄色葡萄球菌、丙酸杆菌、大肠杆菌的抗菌剂。
8.权利要求6的抗菌剂，该抗菌剂是抗MRSA的抗菌剂。
9.权利要求6的抗菌剂，该抗菌剂是抗疮疱丙酸杆菌的抗菌剂。
10.粉刺治疗剂，该治疗剂含有赤竹单宁酸。
11.抗菌性组合物，该组合物含有赤竹提取物和有机酸。
12.权利要求11的抗菌性组合物，该组合物为油墨、涂料、食品添加剂、饮料、调味料、宠物食品、塑料制品或粘结剂。
13.抗气性坏疽菌的抗菌剂，该抗菌剂含有赤竹提取物。
14.权利要求13的抗菌剂，其中所述气性坏疽菌为梭菌属菌。
15.抗无芽孢厌氧性革兰氏阳性球菌的抗菌剂，该抗菌剂含有赤竹提取物。
16.权利要求15的抗菌剂，其中所述无芽孢厌氧性革兰氏阳性球菌为Finegoldia、Micromonas、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、阿托波氏菌属(Atopobium)或孪生球菌属(Gemella)。
17.抗无芽孢厌氧性革兰氏阴性杆菌的抗菌剂，该抗菌剂含有赤竹提取物。
18.权利要求17的抗菌剂，其中所述无芽孢厌氧性革兰氏阴性杆菌为普雷沃氏菌属(Prevotella)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、嗜胆菌属(Bilophila)、脱硫弧菌属(Desulfovivrio)或梭杆菌属(Fusobacterium)。
19.抗阴道炎和细菌性阴道病相关微生物的抗菌剂，该抗菌剂含有赤竹提取物。
20.权利要求13-19中任一项的抗菌剂，该抗菌剂还含有有机酸。
21.含有赤竹提取物的调味料。
22.权利要求21的调味料，该调味料为含有赤竹提取物的食盐。
23.权利要求21或22的调味料，该调味料还含有有机酸。
24.含有赤竹提取物的农药。
25.权利要求24的农药，该农药还含有有机酸。
26.含有赤竹提取物的农业用杀菌剂。
27.权利要求26的农业用杀菌剂，该杀菌剂还含有有机酸。
28.含有赤竹提取物的防腐剂。
29.权利要求28的防腐剂，该防腐剂还含有有机酸。
全文摘要
含有赤竹提取物的抗破伤风杆菌剂、含有赤竹提取物和有机酸的抗真菌剂、含有赤竹提取物的抗病毒剂、含有赤竹单宁酸的抗菌剂、含有赤竹提取物和有机酸的抗菌性组合物。
文档编号A01N37/04GK1674925SQ0381943
公开日2005年9月28日 申请日期2003年6月13日 优先权日2002年6月13日
发明者土田裕三, 土田小太郎, 土田宪次郎, 渡边邦友, 中村良子, 岩泽笃郎 申请人:株式会社凤凰堂