|
导读：研究旨在探究百里香酚和植酸对猪源大肠杆菌和沙门氏菌的抑制效果，为进一步改善猪舍环境和猪肠道功能研究提供参考。试验采用牛津杯法、二倍稀释法和平板涂布法，分别测定百里香酚和植酸对两种猪源致病菌的抑菌圈直径、最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）的影响。结果表明：猪源大肠杆菌和沙门氏菌对50 mg/mL百里香酚表现为高度敏感，对17.5%植酸表现为极度敏感。百里香酚对猪源大肠杆菌MIC和MBC分别为1.56 mg/mL和3.12 mg/mL，对猪源沙门氏菌MIC和MBC均为1.56 mg/mL；植酸对猪源沙门氏菌的抑制效果强于猪源大肠杆菌，对猪源大肠杆菌MIC和MBC均为4.37%，对猪源沙门氏菌MIC和MBC均为2.18%。说明百里香酚和植酸对猪源大肠杆菌和沙门氏菌具有较好的抑菌效果，在抑菌活性物质筛选中具备较好的应用前景。全文已在《饲料工业》2023年第10期刊出。
随着现代畜牧业的发展，大多数地区养殖行业已经形成集约化、规模化的养殖模式。大量未处理的畜禽粪便及其废弃物的排放容易引起严重的水体污染、土壤污染以及大气污染。猪粪便中有多种病原微生物，其中大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等为主要的致病性病原菌[1]。有研究发现,作为条件致病菌，粪便中的大肠杆菌和沙门氏菌都具有水平和垂直传播的特点，一年四季均会发病且常发生两种菌混合感染现象，不仅对养殖生产造成严重的经济损失,甚至威胁人类的健康[2-3]。由于抗生素的长期滥用，病原菌的耐药性也越来越强[4]，抑菌天然活性物质研究应用变得关键，张坤等[5]研究了植物精油在苹果病害病原菌中的抑菌作用，发现陈皮精油、松树油、薄荷精油、柠檬精油对黑腐皮壳菌和链格孢苹果专化型菌具有抑制效果，植物源天然药物也可通过改变菌体细胞膜通透性抑制生物膜的形成，影响蛋白质合成和遗传物质来发挥抑菌作用[6]。
因此，天然植物抗菌物质的筛选及开发利用越来越重要，合理使用天然活性物质有利于调节动物肠道微生物菌群生态平衡，有效提高动物的生产性能，也能达到改善生态环境的效果，且具有无副作用、绿色安全等优点[7-8]，具有良好的应用前景。试验选取了酚类和有机酸类植物提取物，探究其对猪源大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌效果，为进一步猪肠道功能和改善猪舍环境研究提供参考。
从腹泻猪的粪便中分离鉴定出猪源大肠杆菌和沙门氏菌，由延安大学生命科学学院实验室分离鉴定。LB琼脂培养基、LB肉汤培养基，均购自北京奥博星生物有限公司；百里香酚、植酸（BR，70%）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO），均购自上海源叶生物科技有限公司；0.22 μm水系微孔滤膜，购自西安鑫茂仪器设备有限公司。HPX-9162MBE电热恒温培养箱，购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂；MQD-B2R叠加式全温振荡培养箱，购自上海晏泉仪器有限公司；HFsafe-1200A2生物安全柜，购自上海力申科学仪器有限公司；GR110DA高压蒸汽灭菌锅，购自致微（厦门）仪器有限公司；Multiskan Sky酶标仪，市购；培养皿、牛津杯，购自盐城市悦成贸易有限公司。百里香酚溶液的制备：称取一定量的百里香酚溶于DMSO中，旋涡振荡混匀，配成100 mg/mL溶液，使用0.22 μm滤膜过滤除菌，4 ℃保存，备用。植酸溶液的制备：称取一定量的植酸溶于无菌水中，旋涡振荡混匀，配成35%溶液，使用0.22 μm滤膜过滤除菌，4 ℃保存，备用。菌悬液的制备：把试验菌种先接种在LB琼脂培养基平板上，37 ℃恒温培养24 h后挑取1个特征性菌落，接种于10 mL的LB液体培养基中，37 ℃恒温培养18 h；从该培养液中移取100 μL加到10 mL新鲜LB培养基中，继续37 ℃培养18 h，将细菌培养至对数生长期，待用。采用双层平板透明圈法，即取5 mL高压灭菌的LB琼脂倒入层无菌培养皿，待凝固后迅速在平板上放入4只灭菌过的牛津杯，接着加入混有试验菌的培养基15 mL。待培养基凝固后取出牛津杯，分别向每个孔中加入100 μL上述制备好的植物提取物溶液；对照组分别为相同体积的DMSO和无菌水。将平板置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，观察并测量抑菌圈的直径，每个浓度做3次重复取平均值。参考贾睿等[9]和Wang等[10]的方法，以二倍等度稀释96孔板法测定植物提取物对大肠杆菌和沙门氏菌的MIC值。将两种细菌分别接种于LB液体培养基内，37 ℃、200 r/min条件下培养至对数期（OD600为0.5），取100 μL稀释好的植物提取物溶液与100 μL对数期菌液，于96孔板内并混合均匀，37 ℃培养24 h，通过酶标仪测定菌液OD600，以没有菌体生长所对应的植酸终质量浓度为MIC，每个处理设置3个重复。采用琼脂培养基平板法，取MIC以上未见细菌生长的孔内混合液于LB琼脂培养基上，均匀涂布，37 ℃恒温培养箱中培养24 h，观察有无细菌生长，以不生长菌落的平板所对应孔中的最低浓度为该药物的MBC。采用Excel 2010和SPSS 22.0对数据结果进行处理，结果以“平均值±标准误”表示。根据李美发等[11]抑菌圈敏感判定标准：抑菌圈直径≥20 mm，极度敏感；抑菌圈直径15~<20 mm，高度敏感；抑菌圈直径10~<15 mm，中度敏感；抑菌圈直径<10 mm，低度敏感。测定结果见表1及图1、图2。结果表明，当百里香酚浓度为50 mg/mL时，对大肠杆菌和沙门氏菌呈高度敏感。当植酸质量浓度为17.5%时，对大肠杆菌和沙门氏菌呈极度敏感；且随着植酸浓度的升高，抑菌圈直径逐渐变大，抑菌效果越加明显。百里香酚和植酸均具有一定的抑制效果，其中百里香酚对大肠杆菌和沙门氏菌的MIC值均为1.56 mg/mL，植酸对大肠杆菌的MIC值为4.37%，对沙门氏菌的MIC值为2.18%，二者均表现出良好的抑菌活性，见表2、表3。百里香酚对猪源大肠杆菌的MBC值为3.12 mg/mL，对猪源沙门氏菌的MBC值分1.56 mg/mL，植酸对猪源大肠杆菌的MBC值为4.37%，对猪源沙门氏菌的MBC值为2.18%，见表4、表5。在禽畜养殖环境出现卫生状况差、消毒不彻底、空气流通不足等情况时，极易发生大肠杆菌病、沙门氏菌单一或混合感染的情况[2]。有研究表明，大肠埃希氏菌属会造成动物的腹泻、呕吐、出血性结肠炎等疾病，引发大规模的流行性疾病[12-13]，其中断奶仔猪腹泻也是影响我国生猪养殖业的重要疾病之一。沙门氏菌与其他病原混合感染是现在生猪养殖的重要疾病之一[14]。胡心怡等[15]研究发现，百里香酚与肉桂醛可以通过破坏沙门氏菌细胞膜完整性，干扰其正常新陈代谢使菌体死亡，二者协同作用可以有效抑制有害微生物的生长。杨阳等[16]采用百里香酚、肉桂醛和香芹酚复配溶液处理大肠埃希氏菌，发现可破坏其细胞壁、膜结构，造成内容物流失，细菌解体，达到抑菌效果。百里香酚除了能够破坏菌体细胞膜结构，影响生物膜、蛋白质形成和功能发挥抗菌作用外，还有增强宿主免疫、间接调控肠道菌群的作用[17]。另有研究表明，百里香酚等植物精油和有机酸复配可以改善畜禽肠道健康，提高动物生长性能[18]。本试验中，一定浓度的百里香酚对猪源大肠杆菌和沙门氏菌作用表现为高度敏感，表明百里香酚具有较好的抑菌活性，确定其对猪源大肠杆菌的MIC与MBC值分别为1.56 mg/mL和3.12 mg/mL，对猪源沙门氏菌MIC和MBC值均为1.56 mg/mL。严欣茹等[19]研究发现，复配酸化剂在一定程度上能抑制大肠杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌的生长，酸化剂可作为禽畜饮用水消毒用品或在饮用水和饲料中适量添加，有利于动物健康。有机酸可通过自由扩散进入菌体，改变细胞内环境稳定，干扰正常代谢，也会破坏菌体膜完整性，阻断生物大分子物质的合成，抑制细菌生长[20]。植酸具有较好的抑菌活性，在食品保鲜添加方面已有应用研究[21-22]，但在禽畜养殖相关研究较少。侯伟峰等[23]研究发现，植酸可以破坏大肠杆菌细胞壁、细胞膜完整性，使菌体细胞质外渗，使碱性磷酸酶含量和电导率增加，进一步抑制菌体生长。高飞雄等[24]研究发现，蒲公英植酸可通过破坏沙门氏菌细胞膜结构，使内容物外泄和细胞凋亡，且浓度越高抑制作用越强。本试验中，17.5%植酸对两种菌表现为极度敏感，植酸对沙门氏菌的抑制作用强于大肠杆菌，且随溶液浓度增加抑菌效果也增强，这与已有研究结果一致。本试验中，确定了植酸对猪源大肠杆菌的MIC和MBC值均为4.37%，对猪源沙门氏菌MIC和MBC值均为2.18%，认为植酸对猪源大肠杆菌和沙门氏菌均有较好的抑菌效果。抑菌性天然植物提取物的筛选和应用对猪体健康生长和发育具有重要意义，也对预防猪腹泻有积极作用。植物提取物成分复杂，其单一成分或者多种成分之间的相互作用及其可能存在的抑菌机制还有待深入研究。综上所述，猪源大肠杆菌与沙门氏菌对百里香酚和植酸都存在一定的敏感性，其中对50 mg/mL的百里香酚表现为高度敏感，对17.5%植酸表现为极度敏感；百里香酚对猪源大肠杆菌的MIC和MBC值分别为1.56 mg/mL和3.12 mg/mL，对猪源大肠杆菌的MIC和MBC值均为1.56 mg/mL；植酸对猪源大肠杆菌的MBC和MIC值均为4.35%，对猪源沙门氏菌的MBC和MIC值均为2.18%。百里香酚和植酸天然植物提取物均表现出良好的抑菌效果。
|
