 如今，国内实验室的仪器配置已能媲美发达国家，该有的都有的，用得着、用不着的都先买回来再说。说起来，色谱、质谱、光谱我们每天都或多或少的能用到，多数人仪器用的顺手、却讲不出所以然，为什么？因为TA没有看到过这篇帖子啦！ 色谱分析法： 它利用样品中各组分与流动相和固定相的作用力不同（吸附、分配、交换等性能上的差异），先将它们分离，后按一定顺序检测各组分及其含量的方法。 色谱法的特点： （1）分离效率高，复杂混合物，有机同系物、异构体。（2）灵敏度高，可以检测出μg.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。（3）分析速度快，一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。（4）应用范围广，气相色谱：沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析。液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。(5)高选择性:对性质极为相似的组分有很强的分离能力.。不足之处：被分离组分的定性较为困难。 色谱分析法的分类：按两相状态分类，按操作形式分类，按分离原理分类。 按两相状态分类：气相色、液相色谱，超临界流体色谱。 气相色谱：流动相为气体（称为载气）。常用的气相色谱流动相有N2、H2、He等气体，按分离柱不同可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱；按固定相的不同又分为：气固色谱和气液色谱。 液相色谱：流动相为液体（也称为淋洗液）。按固定相的不同分为：液固色谱和液液色谱。超临界流体色谱：流动相为超临界流体。超临界流体是一种介于气体和液体之间的状态。 超临界流体色谱法：是集气相色谱法和液相色谱法的优势而发展起来的一种新型的色谱分离分析技术，不仅能够分析气相色谱不宜分析的高沸点、低挥发性的试样组分，而且具有比高效液相色谱更快的分析速率和更高的柱效率。 按操作形式分类： 柱色谱:固定相装在柱管内；包括填充柱色谱和毛细管柱色谱。纸色谱固定相为滤纸；采用适当溶剂使样品在滤纸上展开而进行分离。薄层色谱固定相压成或涂成薄层；操作方法同纸色谱。 按分离原理分类：吸附色谱；分配色谱；离子交换色谱；凝胶色谱。 色谱图：组分在检测器上产生的信号强度对时间(t)所作的图，由于它记录了各组分流出色谱柱的情况，所以又叫色谱流出曲线。流出曲线的突起部分称为色谱峰。 色谱保留值：是色谱定性分析的依据，它体现了各待测组分在色谱柱上的滞留情况。在固定相中溶解性能越好，或与固定相的吸附性能越强的组分，在柱中的滞留时间越长，或者说将组分带出色谱柱所需的流动相体积越大。所以保留值可以用保留时间和保留体积两套参数来描述。 色谱图上的色谱流出曲线可以说明什么问题： 根据色谱峰的数目，可判断样品中所含组分的最少个数；根据色谱峰的保留值进行定性分析；根据色谱峰的面积或峰高进行定量分析；根据色谱峰的保留值和区域宽度评价色谱柱的分离效能；根据两峰间的距离，可评价固定相及流动相选择是否合适。 分配比：在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比。 在色谱流出曲线上，两峰之间的距离主要由两组分在两相间的分配系数还是扩散速度决定？为什么？ 答：分配系数。两峰间的距离由热力学因素决定，两组分在两相中分配系数差异越大，两峰间的距离则相差越大，越容易被分离。而扩散速度是动力学因素，反映在色谱流出曲线上即为色谱峰的区域宽度（形状）。 色谱理论需要解决的问题： 色谱分离过程的热力学和动力学问题。影响分离及柱效的因素与提高柱效的途径，柱效与分离度的评价指标及其关系。 组分保留时间为何不同？色谱峰为何变宽？ 组分保留时间：色谱过程的热力学因素控制；（组分和固定液的结构和性质）。色谱峰变宽：色谱过程的动力学因素控制；（两相中的运动阻力，扩散作用）。塔板理论和速率理论分别从热力学和动力学的角度阐述了色谱分离效能及其影响因素。 半经验理论： 将色谱分离过程比拟作蒸馏过程，将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复（类似于蒸馏塔塔板上的平衡过程）。 塔板理论的特点： 塔板理论引入了塔板数和塔板高度作为柱效的衡量指标；不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质；柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。 塔板理论的不足： 塔板理论的基本假设不符合色谱柱的实际分离过程。塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的流动相流速下柱效不同的实验结果，不能说明色谱峰为什么会展宽，同时未能指出影响柱效的因素及提高柱效的途径和方法。 H - u曲线与最佳流速： 由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影响使得存在着一个最佳流速值，即速率方程式中塔板高度对流速的一阶导数有一极小值。以塔板高度H对应流速u作图，曲线最低点的流速即为最佳流速。 色谱定性方法： 1、与标样对照的方法：利用保留值定性：通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中的位置。不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比。利用加入法定性：将纯物质加入到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化。2、利用文献保留值定性：利用相对保留值r21定性。相对保留值r21仅与柱温和固定相性质有关。在色谱手册中都列有各种物质在不同固定相上的保留数据，可以用来进行定性鉴定。 色谱定量分析： 1、定量校正因子：试样中各组分质量与其色谱峰面积成正比，即：m i = fi’ ·Ai ；绝对校正因子：比例系数f i ，单位面积对应的物质量： f i ’ =m i / Ai ；相对校正因子f i ：即组分的绝对校正因子与标准物质的绝对校正因子之比。 2、常用的几种定量方法： （1）归一化法：特点及要求：归一化法简便、准确；进样量的准确性和操作条件的变动对测定结果影响不大；仅适用于试样中所有组分全出峰的情况。 （2）外标法——标准曲线法：特点及要求：外标法不使用校正因子，准确性较高，操作条件变化对结果准确性影响较大。对进样量的准确性控制要求较高，适用于大批量试样的快速分析。 （3）内标法：内标物要满足以下要求：（a）试样中不含有该物质；（b）与被测组分性质比较接近；（c）不与试样发生化学反应；（d）出峰位置应位于被测组分附近，且能分离开；（e）加入量适中并与待测组分接近。内标法特点：内标法的准确性较高，操作条件和进样量的稍许变动对定量结果的影响不大；每个试样的分析，都要进行两次称量，不适合大批量试样的快速分析；若将内标法中的试样取样量和内标物加入量固定，则：wi=Ai/As *常数。 1 气相色谱法（GC）：是以气体为流动相的色谱分析法。 2 气相色谱要求样品气化，不适用于大部分沸点高和热不稳定的化合物，对于腐蚀性能和反应性能较强的物质更难于分析。 大约有15%-20%的有机物能用气相色谱法进行分析。 3 气相色谱仪的组成：气路系统、进样系统、分离系统、检测系统、温控系统、记录系统。 4 气路系统：包括气源、净化器和载气流速控制；常用的载气有：氢气、氮气、氦气:。 5 进样系统：包括进样装置和气化室。气体进样器（六通阀）：试样首先充满定量管，切入后，载气携带定量管中的试样气体进入分离柱；液体进样器：不同规格的微量注射器，填充柱色谱常用10μL；毛细管色谱常用1μL；新型仪器带有全自动液体进样器，清洗、润冲、取样、进样、换样等过程自动完成，一次可放置数十个试样。 6 进样方式：分流进样：样品在汽化室内气化，蒸气大部分经分流管道放空，只有极小一部分被载气导入色谱柱；不分流进样：样品直接注入色谱的汽化室，经过挥发后全部引入色谱柱。 7 分离系统：色谱柱：填充柱（2-6 mm直径，1-5 m长），毛细管柱（0.1-0.5 mm直径, 几十米长）。 8 温控系统的作用：温度是色谱分离条件的重要选择参数；:气化室、色谱柱恒温箱、检测器三部分在色谱仪操作时均需控制温度；气化室：保证液体试样瞬间气化；检测器：保证被分离后的组分通过时不在此冷凝；色谱柱恒温箱：准确控制分离需要的温度。 9 检测系统：作用：将色谱分离后的各组分的量转变成可测量的电信号:。指标：灵敏度、线性范围、响应速度、结构、通用性。通用型——对所有物质均有响应； 专属型——对特定物质有高灵敏响应。检测器类型：浓度型检测器：热导检测器、电子捕获检测器；质量型检测器：氢火焰离子化检测器、火焰光度检测器。 10 热导检测器的主要特点：结构简单，稳定性好；对无机物和有机物都有响应，不破坏样品；灵敏度不高。 11 氢火焰离子化检测器的特点： 优点：(1)典型的质量型检测器；(2)通用型检测器（测含C有机物）；(3)氢焰检测器具有结构简单、稳定性好、灵敏度高、响应迅速、死体积小、线性范围宽等特点；(4)比热导检测器的灵敏度高出近3个数量级，检测下限可达10-12g·g-1。 缺点：(1)对载气要求高(2)检测时要破坏样品，无法回收样品(3)不能检测永久性气体、水及四氯化碳等。 12 电子俘获检测器的特点：对卤素、硫、磷、氮、氧有很强的响应；灵敏度高，可用于痕量农药残留物的分析；线性范围较窄。 13 火焰光度检测器（FPD）：是一种对含硫、磷化合物具有高选择性的检测器。含硫、磷化合物在富氢火焰中燃烧被打成有机碎片，发出不同波长的特征光谱。 14 固定相：固体固定相：固体吸附剂；液体固定相：由载体和固定液组成；聚合物固定相。 15 固体固定相：一般为固体吸附剂，常用的有活性炭，硅胶，氧化铝和分子筛。 优点：吸附容量大、热稳定性好、价格便宜； 缺点：柱效低、吸附活性中心易中毒，使用前要进行活化。 应用：主要用于惰性气体、H2、O2、N2、CO、CO2和CH4等一般气体和低沸点物质。 16 作为载体使用的物质应满足的条件：表面有微孔结构，孔径均匀，比表面积大；:化学和物理惰性，即与样品组分不起化学反应，无吸附作用或吸附很弱；热稳定性好；有一定的机械强度和浸润性，不易破碎；具有一定的粒度和规则的形状，最好是球形。 17 载气种类的选择：检测器的适应性；载气流速的大小。 18 柱温的选择： （1）首先应使柱温控制在固定液的最高使用温度（超过该温度固定液易流失）和最低使用温度（低于此温度固定液以固体形式存在）范围之内。 （2）提高柱温，可以改善传质阻力，有利于提高柱效，缩短分析时间，但降低了容量因子和选择性，不利于分离。一般的原则是：在使最难分离的组分尽可能分离的前提下，尽量采用较低的柱温，但以保留时间适宜，峰形不拖尾为度。 （3）柱温一般选择在接近或略低于组分平均沸点时的温度。 （4）组分复杂，沸程宽的试样，采用程序升温。 19 载体和固定液含量的选择：配比：固定液在载体上的涂渍量，一般指的是固定液与担体的百分比，填充柱的配比通常在5%～25%之间。配比越低，担体上形成的液膜越薄，传质阻力越小，柱效越高，分析速度也越快。配比较低时，固定相的负载量低，允许的进样量较小。分析工作中通常倾向于使用较低的配比。 20 进样条件的选择：进样量应控制在柱容量允许范围及检测器线性检测范围之内。进样要求动作快、时间短；气化室一般较柱温高30~70°C。 21 提高色谱分离能力的途径：(1)塔板理论：增加柱长，减小柱径，即增加柱子塔板数；(2)速率理论：减小组分在柱中的涡流扩散和传质阻力，可降低塔板高度。 22 毛细管色谱柱的结构特点： （1） 不装填料阻力小，长度可达百米的毛细管柱，管径0.2mm。: （2）气流单途径通过柱子，消除了组分在柱中的涡流扩散。 （3）固定液直接涂在管壁上，总柱内壁面积较大,涂层很薄，则气相和液相传质阻力大大降低。 （4）毛细管色谱柱柱效高达每米3000～4000块理论塔板，一支长度100米的毛细管柱，总的理论塔板数可达104～106。 23 毛细管色谱具有以下优点： （1）分离效率高：比填充柱高10～100倍；: （2）分析速度快：用毛细管色谱分析比用填充柱色谱速度 （3）色谱峰窄、峰形对称。较多采用程序升温方式； （4）灵敏度高，一般采用氢焰检测器。 （5）涡流扩散为零。 1 与气相色谱相比液相色谱的优点：与气相色谱法相比，液相色谱法不受样品挥发性和热稳定性及相对分子质量的限制，只要求把样品制成溶液即可，非常适合于分离生物大分子、离子型化合物，不稳定的天然产物以及其他各种高分子化合物等。此外，液相色谱的流动相不仅起到使样品沿色谱柱移动的作用，而且与固定相一样，与样品分子发生选择性的相互作用，这就为控制和改善分离条件提供了一个额外的可变因素。而气相色谱法采用的流动相是惰性气体，对组分没有亲和力，仅起运载作用。 2 流动相使用前必须脱气。常用的脱气方法有：低压脱气法（电磁搅拌、水泵抽空，可同时加热或向溶剂吹氮气）、吹氦气脱气法和超声波脱气法等。 3 梯度洗脱：用两种（或多种）不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续改变流动相中溶剂的配比和极性，通过流动相中极性的变化来改变被分离组分的分离因素，以提高分离效果。 4 高压梯度（内梯度）：特点是先加压后混合。将溶剂用高压泵增压以后输入色谱系统的梯度混合室，加以混合后送入色谱柱。 低压梯度（外梯度）：特点是先混合后加压。在常压下预先按一定的程序将溶剂混合后再用泵输入色谱柱。 5 进样系统要求：良好的密封性，最小的死体积，最好的稳定性，进样时对色谱系统压力、流量影响较小。 6 分离系统：色谱柱是实现分离的核心部件。由柱管和固定相组成。柱管为直型不锈钢管。一般色谱柱长5~30 cm，内径4~5 mm，凝胶色谱柱内径3~12 mm，而制备色谱柱内径则可达25 mm。一般淋洗溶剂在进入色谱分离柱之前，先通过前置柱。HPLC柱的填料颗粒粒径一般约为3~10 ?m，填充常采用匀浆法。色谱柱的发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。 7 检测系统：作用——用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。紫外-可见吸收检测器、光电二极管阵列检测器、示差折光检测器、荧光检测器、电化学检测器。 8 高效液相色谱法对流动相的要求：流动相不与色谱柱发生不可逆化学变化，以保持柱效或柱子的保留性质较长时间不变；对待测样品有足够的溶解能力；与所用检测器相匹配；粘度尽可能小，以获得较高的柱效；流动相纯度要高，价格便宜，毒性小。 9 离子交换色谱法原理：离子交换色谱法的固定相是离子交换树脂，流动相是水溶液，它是利用待测样品中各组分离子与离子交换树脂的亲和力的不同而进行分离的。 10 离子交换色谱法流动相：水的缓冲溶液。阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。 11 凝胶色谱法流动相：能溶解样品且与凝胶相似(润湿凝胶并防止吸附作用)、粘度小(增加扩散速度)。常用四氢呋喃、苯、氯仿、水等。 12 影响分离的因素与提高柱效的途径: （1）液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍左右，故降低传质阻力是提高柱效主要途径。 （2）由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。 （3）液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。 （4）恒温改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。 （5）流速大于0.5 cm/s时, H～u曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。 （6）气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。 质谱的作用：准确测定物质的分子量；质谱法是唯一可以确定分子式的方法；根据碎片特征进行化合物的结构分析。 质谱分析的过程： 1、进样，化合物通过汽化引入电离室； 2、离子化，在电离室，组分分子被一束加速电子碰撞，撞击使分子电离形成正离子； 3、离子也可因撞击强烈而形成碎片离子； 4、荷正电离子被加速电压V加速，产生一定的速度v，与质量、电荷及加速电压有关； 5、加速正离子进入一个强度为B的磁场（质量分析器），发生偏转。 质谱仪的组成：真空系统、进样系统、离子源或电离室、质量分析器、离子检测器。 真空系统作用：是减少离子碰撞损失。若真空度低：大量氧会烧坏离子源的灯丝；会使本底增高，干扰质谱图；引起额外的离子-分子反应，改变裂解模型，使质谱解释复杂化；干扰离子源中电子束的正常调节；用作加速离子的几千伏高压会引起放电等。 进样系统目的：高效重复地将样品引入到离子源中并且不能造成真空度的降低。间歇式进样系统——气体及低沸点、易挥发的液体；直接探针进样——高沸点的液体、固体；色谱进样系统——有机化合物。 质量分析器作用：将离子源产生的离子按质荷比m/z的大小分开。 单聚焦分析器：离子的m/z与R,B, V有关。通过改变磁场可以把不同离子分开。-在一定磁感应强度B下，改变加速电压V可以使不同离子先后通过检测器，实现质量扫描，得到质谱。特点：结构简单，操作方便；只有方向聚焦，无能量聚焦，分辨率低。 双聚焦分析器：实现方向聚焦和能量（速度）聚焦；对于动能不同的离子，通过调节电场能，达到聚焦的目的。特点：分辨率高。 四级杆质量分析器：特点：结构简单，体积小、重量轻，扫描速率快，适合与色谱联机。 飞行时间质量分析器：特点：质量范围宽，扫描速率快，既不需磁场也不需电场，只需要直线漂移空间。 离子阱质量分析器：特定m/z离子在阱内一定轨道上稳定旋转，改变端电极电压，不同m/z离子飞出阱到达检测器。特点：结构简单、易于操作、灵敏度高。 质谱仪的分辨率：分辨率（R）指质谱仪能区别邻近两个质谱峰的能力。对两个相等强度的相邻峰，当两峰间的峰谷不大于其峰高10％时，则认为两峰已经分开。 质谱图中主要离子峰的类型：分子离子峰、同位素离子峰、碎片离子峰、亚稳离子峰、重排离子峰。 相对分子质量的测定：分子离子峰的m/z相当于该化合物的相对分子质量。一般除同位素离子峰外，分子离子峰是质谱图中最大质荷比的峰，位于质谱图的最右端。 确认分子离子峰的方法： （1）分子离子峰必须符合氮数规则。有机化合物含有偶数个氮原子或不含氮原子，分子离子峰的m/z一定是偶数；含奇数个氮原子，分子离子峰的m/z一定是奇数。 （2）分子离子峰与相邻离子峰的质量差应合理，如不可能出现比分子离子峰质量小4～13个质量单位的峰。 （3）当化合物中含S,Br, Cl时，可利用M+?, (M+2) +?等同位素离子峰的比例来确认分子离子峰。 （4）改变质谱仪的操作条件，提高分子离子峰的相对强度。采用化学电离源或降低电子轰击源电压可获得较强的M+?峰。 气相色谱-质谱联用仪： 质谱：纯物质结构分析。 色谱：化合物分离，定性能力差。 色谱-质谱联用：共同优点。GC-MS；LC-MS；CE-MS，色谱是质谱的进样及分离系统；质谱是色谱的检测器。 主要问题：接口技术；除去色谱中大量的流动相分子。 适用范围：适用于挥发度低、难气化、极性强、相对分子质量大及热稳定性差的样品。 |
|
|
来自： 刘花儿 > 《化学分析专业资料》
