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血片制作与染色 一、血片制作 （一）所需器材 1、载玻片：玻片使用前应清洗。新玻片应先浸入有液态洗涤剂的清水中10~20分钟，然后用干净棉巾逐个擦拭，再用清水冲洗干净，晾干，最后用干净、柔软的棉巾将玻片擦亮。用于特殊的目的时，最后可将玻片浸泡在95％酒精中5~10分钟，再将玻片擦干擦亮。已用过的玻片应先浸泡于洗涤剂溶液中1~2天，或浸泡于煮沸的5％肥皂水中1~2小时，再移到新配置的洗涤剂溶液中1~2小时，逐个擦去玻片上旧的血膜痕迹，用清水漂洗干净，再将玻片擦干擦亮。洗净的玻片每10~20张用白纸包好放入塑料袋内，保存于干燥环境中备用。 2、采血针：使用一次性釆血针。 3、玻片盒：为防止污染和苍蝇吸食血膜，新制作的血膜应放在玻片盒中，厚血膜放置时要保持水平，直到充分干燥。 4、75％酒精棉球：用于采血前后的消毒。 5、记号笔或铅笔：用于玻片上书写号码。 （二）采血部位及取血方法 采血部位以耳垂较为合适，也可在手指末端采血，婴儿可从拇趾或足跟取血。先用75％酒精棉球消毒取血部位后，以一次性采血针迅速刺入取血部位1~2mm深，然后用左手大拇指、食指和右手中指协同挤出血滴。 （三）涂制血膜 取玻片2张，1张作载片，1张作推片（具有光滑边缘）。用右手拇指和食指夹持推片侧缘中部，用推片的左下角刮取血液4~5μl，再用该端中部刮取血液1~1.5μl。将左下角的血滴涂于载片的中央偏右处，由里向外划圈涂成直径为0.8~1cm的圆形厚血膜（厚度以1个油镜视野内可见到5~10个白细胞为宜）。用干棉球抹净玻片角上的血渍，然后将推片下缘平抵载玻片的中线，当血液在载玻片与推片之间向两侧扩展至约2cm宽时，使两玻片保持25°～35°角，从右向左迅速向前推成舌状薄血膜，制成的薄血膜应在玻片上形成平铺的血细胞，细胞之间互相接触而不相互重叠。每张载玻片上分别做1个薄血膜，1个厚血膜。 取干净玻片及推片各一张，用右手大拇指和食指夹持推片侧缘中部，用推片的左下角刮取血液4～5μl（约火柴头大小），再用该端中部刮取血液1～1.5μl。将左下角的血滴涂于载片的中央偏右，由里向外划圈涂成直径为0.8～1cm的圆形厚血膜（厚血膜的厚度以一个油镜视野内可见到5～10个白细胞为宜）。用干棉球抹净角上的血渍，然后将推片下缘平抵载玻片的中线，当血液在载玻片与推片之间向两侧扩展至约2cm宽时，使两玻片保持25°～35°角，从右向左迅速向前推成舌状薄血膜。
（四）血膜的保存 血膜制成后，立即将受检者号码写在玻片上，血膜朝下插入直竖的标本盒内，让血膜自然干燥后才能染色。吉氏染色时薄血膜在染色前须经甲醇固定，而厚血膜在染色前必须溶血，但新制作的厚血膜也可直接染色。血膜放置时间，夏天不宜超过48小时，冬天不宜超过72小时，否则厚血膜会自然固定而不能溶血，影响镜检。不能及时染色的血膜，可先用甲醇固定薄血膜，将厚血膜溶血，晾干后包好，放入干燥器中，置于冰箱内保存。临用时，将干燥器放置室温中1~2小时后取出血片。 二、血膜的染色 （一）染色液的制备 目前常用的血膜染剂有吉氏和瑞氏两种。吉氏染剂不仅适用于厚血膜和批量血膜的染色，而且效果稳定，染色时间和染液浓度对染色结果影响较小，染色后的血膜保存时间较长，同时吉氏染剂能长期保存而不变质，染色技术也易掌握，被推荐使用。 吉氏粉 5g，甲醇250ml，甘油250ml。将吉氏粉置于研钵中，加入少量甘油充分研磨，边加边磨，至甘油加完为止，倒入500ml有塞玻璃瓶中。在研钵中加入少量甲醇，洗掉剩余部分，倒入瓶内，再次加甲醇，洗后再倒入瓶中，至甲醇洗净研钵为止。塞紧瓶塞，充分摇匀，室温内放置，每天用力摇动溶液5分钟，3天后即可使用。 另一种方法是在带有紧口瓶塞的硬质玻璃瓶中放入约50个玻璃珠（直径3~5mm）。用玻璃漏斗把甘油灌入瓶中，把吉氏粉放入漏斗中，用甲醇缓慢地把所有染料粉冲入瓶内，将瓶塞塞紧，置于室温内，每天用力摇动5分钟，3天后即可使用，保存时间长则更好。 （二）染色用水 常用的染液的稀释用水和染色的冲洗用水，是中性的蒸馏水或经煮沸过滤的冷开水，也可用井水、河水、泉水或雨水。为了使血膜着色较好，应用pH7.0～7.2水效果最佳。为此，可配制缓冲液用于染液的稀释和染色后的冲洗。配制pH6.6~7.4缓冲液时，先制备好两种贮备液。贮备液Ⅰ为每1 000ml蒸馏水含9.5g磷酸氢二钠，贮备液Ⅱ为每1 000ml蒸馏水含9.07g磷酸二氢钾。配制pH6.6~7.4的缓冲液时，将两种贮备液按一定比例混合后，用蒸馏水稀释成各种浓度的溶液。
（三）吉氏染色方法 染色前薄血膜要用甲醇或无水乙醇固定，厚血膜用蒸馏水或清水溶血。单张血膜染色可取蒸馏水或缓冲液1ml加入吉氏染液1滴，混合均匀后，滴在厚、薄血膜上，染色20~30分钟，然后水洗、晾干。 成批染色时，将血膜朝一个方向插入染色缸中，或每对玻片血膜朝外，背靠背插入染色缸中，倒入新配的2％吉氏染液(2ml吉氏原液同98ml蒸馏水缓冲液混匀），浸没厚薄血膜，染色30分钟后，向染色缸中注入缓冲液或自来水，直到溢出，除掉染液表面上的浮渣，将染色缸中残余的染液倾出，加入新水，反复冲洗2~3次，取出玻片，将血膜朝下插在晾片板上干燥。 染薄血膜时，染液浓度可稍高、时间稍长一些，而染厚血膜时，则染液浓度可稍低、时间稍短一些。当同一张玻片上厚血膜与薄血膜同时染色时，应按照厚血膜的染色方法，以免厚血膜过染而镜检困难。 褪色或染色效果不佳时，可重新染色，先用二甲苯反复洗去血膜上的油迹，再用75％酒精滴在厚、薄血膜上，用水反复冲洗数次，至厚血膜不见蓝色为止。取1ml蒸馏水加入1滴吉氏染液，混匀后滴在厚、薄血膜上，染色1~4小时（根据血片存放时间而定)。清水冲洗2~3分钟，加1~2滴75％酒精于血膜上，1~2秒钟后用水冲洗，待干。 （四）影响血膜染色质量的因素 血片染色好坏，除与玻片的清洁程度、血膜制作的质量和染色技术等有关外，还与下列因素有关: 1、染剂和溶剂的质量：染料、甲醇和甘油如不纯，常使配成的染液偏酸或偏碱，影响染色效果。因此，必须用分析纯的甲醇和中性甘油，配制时所用器具必须干净无水。新配制的染液应先试染，以酸碱度最适宜的水稀释，观察染色是否理想，否则需重新制备染液。 2、染液的新旧：新配制的染液，一般染色力较弱，且常呈碱性。染液放置时间稍长，染色力逐渐增加，故应在染色前1~2周先将染液制备好。盛染液的瓶子应密封，以免影响染液质量。 3、染液的稀释浓度：染液浓度高，着色快，各种细胞着色深，薛氏点、茂氏点等粗大显著；染液浓度低，着色慢，但各种细胞内部结构着色均匀、清晰，如环状体、子孢子及疟色素等颜色分明，但薛氏点、茂氏点不够清楚。染液稀释后，一般在半小时内使用，时间太长也会影响染色效果。 （三）吉氏染色方法 染色前薄血膜要用甲醇或无水乙醇固定，厚血膜用蒸馏水或清水溶血。单张血膜染色可取蒸馏水或缓冲液1ml加入吉氏染液1滴，混合均匀后，滴在厚、薄血膜上，染色20~30分钟，然后水洗、晾干。 成批染色时，将血膜朝一个方向插入染色缸中，或每对玻片血膜朝外，背靠背插入染色缸中，倒入新配的2％吉氏染液(2ml吉氏原液同98ml蒸馏水缓冲液混匀），浸没厚薄血膜，染色30分钟后，向染色缸中注入缓冲液或自来水，直到溢出，除掉染液表面上的浮渣，将染色缸中残余的染液倾出，加入新水，反复冲洗2~3次，取出玻片，将血膜朝下插在晾片板上干燥。 染薄血膜时，染液浓度可稍高、时间稍长一些，而染厚血膜时，则染液浓度可稍低、时间稍短一些。当同一张玻片上厚血膜与薄血膜同时染色时，应按照厚血膜的染色方法，以免厚血膜过染而镜检困难。 褪色或染色效果不佳时，可重新染色，先用二甲苯反复洗去血膜上的油迹，再用75％酒精滴在厚、薄血膜上，用水反复冲洗数次，至厚血膜不见蓝色为止。取1ml蒸馏水加入1滴吉氏染液，混匀后滴在厚、薄血膜上，染色1~4小时（根据血片存放时间而定)。清水冲洗2~3分钟，加1~2滴75％酒精于血膜上，1~2秒钟后用水冲洗，待干。 （四）影响血膜染色质量的因素 血片染色好坏，除与玻片的清洁程度、血膜制作的质量和染色技术等有关外，还与下列因素有关: 1、染剂和溶剂的质量：染料、甲醇和甘油如不纯，常使配成的染液偏酸或偏碱，影响染色效果。因此，必须用分析纯的甲醇和中性甘油，配制时所用器具必须干净无水。新配制的染液应先试染，以酸碱度最适宜的水稀释，观察染色是否理想，否则需重新制备染液。 2、染液的新旧：新配制的染液，一般染色力较弱，且常呈碱性。染液放置时间稍长，染色力逐渐增加，故应在染色前1~2周先将染液制备好。盛染液的瓶子应密封，以免影响染液质量。 3、染液的稀释浓度：染液浓度高，着色快，各种细胞着色深，薛氏点、茂氏点等粗大显著；染液浓度低，着色慢，但各种细胞内部结构着色均匀、清晰，如环状体、子孢子及疟色素等颜色分明，但薛氏点、茂氏点不够清楚。染液稀释后，一般在半小时内使用，时间太长也会影响染色效果。 镜检 三、薄血膜镜检 镜检疟原虫一般查厚血膜，薄血膜仅作为原虫分类时的参考和血片编号之用切记在只镜检薄血膜时不能得出阴性的结论。 （一）各种疟原虫各期形态鉴别 1、被寄生的红细胞形态大小及染色深浅度（是否褪色）； 2、胞浆色彩及其浓淡，结构疏密，有否空泡及不着色带，体积大小； 3、色素斑点（薛氏点、茂氏点）； 4、查其他各期形态是否存在作参考； 5、色素颗粒的形态、颜色、排列。对于这一点应掌握，尤其是厚血膜更为重要。否则在形态鉴别上会混淆弄错。 （二）疟色素颗粒鉴别 1、与原虫在同一水平面； 2、有立体感； 3、色泽特殊，只有单色（色泽与背景色有关，须将视野放暗些）； 4、形状如米粒状、沙粒状、颗粒状、短杆状，细粒可凝聚成堆。 （三）大滋养体与大配子体的形态鉴别 1、大滋养体：大小一般不超过被寄生的红细胞的3/4。核一个或延长呈带状，周围不着色带不明显。胞浆边缘不整齐，有时有空泡。在厚血膜上表现有活动性，故形态变化很大，胞浆收缩不均匀，有时断裂成团块，疟色素分布凌乱。 2、大配子体：大小几乎充满真个红细胞。核一个，较紧密，常偏于一侧，周围有一圈不染色带。胞浆边缘整齐，无空泡。疟色素平均散在分布。在厚血膜上则体形较小，胞浆收缩均匀，不染色带明显，疟色素分布规则则沿边分布。 （四）裂殖子与血小板的形态鉴别 1、血小板：由骨髓巨噬细胞成熟脱落后解离而成，因此结构松散，严格地说不是个完整细胞（无核）。在吉氏染色中多见显淡红色或淡紫色，中间颗粒为紫红色，形状近似石榴子，且边缘不甚光滑。 2、裂殖子：由成熟裂殖体破裂逸出，以致类似血小板聚集一起，或单个、或三五成群，但形体较血小板小，直径0.7-1.8微米。核较大，相对的难见到胞浆，核染深红色或紫红色，四周胞浆围绕，染蓝色，呈卵园形，边缘光滑。如附近查有疟色素颗粒是有力的佐证。 四、厚血膜镜检 厚血膜由于细胞重迭，干燥缓慢，以致虫体皱缩，空泡消失，胞质变形，加之红细胞被溶解，所以虫种和虫体的鉴别比薄血膜困难，但用血量多，疟原虫镜下密度高，因此检出率，常用于疟原虫检出。 （一）检查方法 1、在厚血膜上先滴香柏油一滴，用油镜（100×）镜检。 2、镜检时应从厚血膜上开始。从上而下，从左到右，在由右至左，这样往返一行接一行，一个视野接一个视野顺序的查完整个血膜。 （二）鉴别要点 1、在厚膜中必须根据疟原虫的核、胞浆、疟色素三个条件鉴别是否是疟原虫及何种虫种。在一般情况下，具备三条中的二条也能给以判定。 2、有时因染色较浅，不见原虫的核和胞浆，只见到典型的疟色素可断定。 3、仅见到核和少许胞浆，或者因染液过偏酸性连胞浆也看不清楚，同时又不见色素，但是只要对被染血膜的颜色、红细胞的残影、疟原虫所处的背景加以综合分析，仍可正确做出判断。 看完血片后，若为阳性，应立即按血片编号登记原虫的种、期，以防差错。为检查后记录结果方便起见，对疟原虫的种、期可使用英文字母缩写作为代号。间日疟=P.v；恶性疟=P.f；三日疟=P.m；卵形疟=P.o；环形体=R（Ring form）；大滋养体=T(trophozoite)；裂殖体=S(Schizont)；配子体=G(Gametocytr)。 五、杂质与疟原虫的鉴别 由于染液和载玻片上可能存在杂质以及染液酸碱度的影响，常与疟原虫混淆，应注意鉴别！见图5-8 （一）疑似疟色素血魔上的染料残渣及灰尘，有时被误认为疟色素，可依据颗粒的大小，色泽及分布范围加以区别。转动显微镜微调时，可见其浮于红细胞上，与疟原虫不在一个平面。 （二）疑似疟原虫核细菌尤其是球菌或白细胞破裂后散出的颗粒，皆为红色小点，最易混淆。但球菌形体较大，边缘光滑，常多见聚集一处，分布较广。嗜中性和嗜酸性粒细胞颗粒，着色较淡，边缘整齐，附近常有白细胞的碎屑。 （三）疑似疟原虫胞质网织红细胞残留物和白细胞残留物通常为蓝色，与疟原虫的胞质相似，如与某些红点结合在一起，易被误认为是疟原虫。鉴别时如形同大滋养体，可依据疟色素的特点加以区别；如形状似小滋养体，可依据虫体大小、折光是否均匀以及核与胞质是否在一个平面上予以区别。
六、疟原虫计数 为了了解病人的严重程度、病人是否需要输血及抗疟药的效果测定疟原虫密度是十分必要的。下面介绍常用的几种计数方法。 （一）半定量计数 用厚血膜每个视野中所观察到疟原虫的平均数可粗略地估计出疟原虫密度。这种方法简便，缺点是计数的疟原虫数受血膜厚度影响，在流行病学上不宜用作定量分析。 国内常用此方法将密度分为6级：全厚血膜查见疟原虫数在10个以内，记录实际数字；全厚血膜查见疟原虫数在10个以上，但平均每个视野不到1个虫，记录“少”；100个视野中查见的疟原虫数平均每个视野1~5个，记录“＋”；100个视野中查见的疟原虫数平均每个视野6~10个，记录“++”；100个视野中查见的疟原虫数平均每个视野11~100个，记录“+++”；100个视野中查见的疟原虫数平均每个视野100个以上，记录“++++ ”。 （二）厚血膜的疟原虫计数 在制作厚血膜的同时，计数每μl血中白细胞数。然后镜检厚血膜，计数每个视野中的疟原虫数和白细胞数，疟原虫密度较高时计数100～200个白细胞即可，密度很低时计数1 000个。用下式算出疟原虫密度。 疟原虫数 ÷ 白细胞数 × 每μl血中白细胞数 = 疟原虫数/μl血。 如果无法进行白细胞计数，则以6 000个白细胞/ μl 血计算。 （三）薄血膜的疟原虫计数 在涂制薄血膜的同时，计数每μl血液中的红细胞数，也可按男性500万个、女性按450万个/μl血计算。镜检薄血膜，算出红细胞的疟原虫感染率，然后按下式算出疟原虫密度。 红细胞疟原虫感染率×红细胞数/μl血＝疟原虫数/μl血 如果疟原虫密度较高，检查1 000个红细胞即可，但疟原虫密度低时，则应检查更多的红细胞。可按公式N=45.5×(I-P)÷P确定需检查的红细胞数。式中N为需要检查的红细胞数，P为1万个红细胞中的疟原虫数，I为血样单位(以1万个红细胞计算），45.5为常数。此外，血膜的不同区域视野中的红细胞疟原虫感染率有较大差别，通常血膜后端和边缘部疟原虫密度常比前半部或中央部高，所以，镜检时不宜只检查一个角落，应顺玻片的横轴检查。镜检时，应当记录下所观察到的各种疟原虫，不要笼统地记作混合感染。 形态学请参考医学寄生虫上下集讲课录像，还有群文件。应检验百佳二群杨东同志要求，他们科要开展该项目，要染色镜检资料，特找了很多相关资料归纳分享，希望对开展此项目的其他同仁有帮助。 |
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