【徕卡课堂】如何对细胞培养进行快速正确的检测——贴壁细胞传代培养流程

生物医学的诸多研究领域中，都需要用活细胞进行一系列实验。哺乳动物的细胞培养是生物学研究中必不可少的环节，这一环节能为实验提供快速生长的不同类型细胞。为适当处理哺乳动物细胞株，必须将其置于可控的条件下培养。这些细胞株需要特定的培养基。此外，为确保细胞生长的稳定性，必须规律地监控其生长状况。当培养皿中的细胞密度达到80%时需要进行传代。'

本文简述了贴壁细胞传代培养的常规流程，以及流程中所有的必要步骤。

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如何进行细胞传代？

细胞传代最常见的方法是，用胰酶等蛋白酶分解破坏细胞间以及细胞-培养基底间的粘连。含EDTA的胰蛋白酶使贴壁生长的细胞从培养皿表面脱落。胰酶消化掉细胞与培养皿之间的黏着斑，EDTA作为钙螯合剂。

EDTA鳌合钙离子后，促进细胞间相互作用的钙粘素被分解，于是细胞彼此分离。一旦与生长表面和周围细胞分离，细胞就很容易分散，并在新的培养皿中进行培养了。

细胞类型不同，相应的培养条件和传代方法也不相同。图1 描述了细胞传代流程中的基本步骤。在整个过程中，确保无菌的工作环境是非常重要的。在传代前、胰酶消化期间、细胞计数时，以及细胞分散后的这几个时间点上，需要使用显微镜对细胞镜检。在实验中，为保持结果的可重复性，记录和整理数据，也是非常重要的。

图 1：传代流程；红色代表需用显微镜检验的步骤。

以下方案描述了在 90mm Petri培养皿中犬肾细胞（MDCK 细胞）传代培养的基本原则。这些是从犬肾远端小管分离出来的上皮细胞。在培养基中，它们会贴壁生长，细胞汇合后，形成单层多角细胞。 

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运用 Leica DMi1 进行贴壁细胞传代培养四步法

第 1 步：细胞检查

图 2：从培养箱中取出细胞，置于显微镜下，快速进行细胞检查。每天都用显微镜观察细胞，确保它们的健康状况（无污染，少量死亡细胞），生长状况与预期一致。

图 3：大部分细胞贴附在培养皿/瓶的底部，培养基应呈橘粉色。由于细胞产生代谢产物（或存在污染！），导致培养基酸化，培养基中的pH 指示剂酚红由红色变成黄色。在指数生长期，MDCK 细胞呈多角形单层排列生长。在普通明场镜头下，很难看到这些细胞。切换带相差功能的物镜观察，更容易找到细胞。在 Leica DMi1 上，只需简单移动滑块将环形光阑置于光路中，即可完成上述操作，如图所示。

图 4：细胞状态的记录对确保实验结果的可重复性非常重要。Leica DMi1 可以配备摄像头和显示屏，通过远程控制即可轻松实现成像和保存操作。

图 5：对比 MDCK 细胞的明场和相差图像。相差的成像效果更佳，令细胞形态观察以及细胞计数更简便。

第 2 步：细胞收集

图 6：用移液枪将培养皿中的旧培养液吸净，放入废液容器中。

图 7：用 5ml 已预热的 PBS（不含钙、镁）小心地将细胞漂洗三遍，去除培养液中残留的胎牛血清 (FBS)。FBS 会抑制胰酶作用。加入 3ml 预热的含EDTA的胰酶，轻轻晃动，令其覆盖培养皿底部的所有细胞。将细胞置于 37°C 培养箱内几分钟，促进细胞脱落。

图8：不同细胞株用胰酶消化时所需时间不同。为了避免胰酶消化过度损伤细胞，每隔几分钟须对细胞进行镜下观察。

图 9：脱落后的细胞呈圆形，在悬浮于胰酶溶液中。细胞脱落后，向培养皿中加入 5ml 培养液，令胰酶失活

图10：轻轻冲洗孔板，将细胞悬浮液转移到50ml 离心管中，并以800 rpm 离心 5 分钟。弃上清，并在10ml 新鲜培养液中将细胞沉淀重悬。

第 3 步：细胞计数

图11：将 100 μL 细胞悬浮液与等体积的 0.4% 台盼蓝溶液混合。台盼蓝不会被活细胞摄取，但能选择性穿透死亡细胞的细胞膜，并将其染成蓝色。将盖玻片覆盖在计数区表面，准备好血细胞计数仪。

图 12：将细胞悬浮液加至计数板（每个计数区大约 4μl），方法：将移液枪头放在盖玻片边缘，然后轻轻吹吸以驱散细胞悬浮液，通过毛细管作用填充整块盖玻片下的区域。大多数情况下，一个计数板有两个计数区，可以分别加入细胞悬浮液。

图 13：将计数板放在显微镜载物台上，并对细胞进行对焦。

对于不同的计数板，计数栅的网格也不同。Fuchs-Rosenthal 计数板上有 16 个大小为 1 平方毫米的计数区，计数区之间用三线分开。每个计数区又被细分成 16 个更小的计数区。对一块细分后的计数区上的细胞进行计数，如图所示。为避免对计数区边缘的细胞重复计数，仅统计计数区两侧线条之间的细胞。在上述示例中，接触上部和左侧界限的细胞应予以计数（较粗的红线）。下部和右侧界限的细胞不予计数。对计数板上5个1平方毫米的矩形计数区内的活细胞和死细胞进行计数。为进行计算，需要将所有 5 个计数区内的计数结果进行汇总。为实现较高的测量精度，还需要对计数板上的其他计数区的细胞进行计数。

根据以下公式，计算细胞浓度：

细胞总量/mL = 计数细胞总量 x 稀释系数 x 10,000 个细胞/mL / 计数区的数量

第 4 步：铺板

图 14：按照需要的传代比例（此处为1:10），用移液枪将所需体积的细胞（适当数目的细胞）吸至新的培养皿中，并将每个培养皿(10 ml) 中的培养液加至所需的最终体积。并在培养皿盖上标明细胞类型、细胞传代的日期以及代数。将细胞放回到37°C 的培养箱中。

图 15：细胞在培养箱中放置过夜，使其贴壁、恢复生长。24 小时后，镜下观察细胞形态、贴壁情况以及是否有污染。

图 16：细胞应贴附于培养皿底部，开始增殖、分裂。更换新的培养液以去除残留胰酶，培养。直至细胞密度足以用于后续实验或进行下一次传代。

在本文实验中使用的徕卡DMi1