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摘 要：兔皮肤真菌病近年来在我国各地流行严重，其病原菌靠传统的表型特征鉴定难以区分，本文从浙江、江苏等各地发病的21个兔场各品种兔中通过培养分离纯化出17株真菌，在培养特性等表型特征初步鉴定的基础上，进一步建立了PCR快速诊断技术，通过基因扩增和序列测定，能够正确作出鉴别诊断，分别鉴定出须癣毛癣菌10株、犬小孢子菌5株和趾间毛癣菌2株，其扩增的基因片段大小分别为692bp、741bp和708bp。 关键词：兔皮肤真菌病；真菌；PCR；诊断
近年来在全国各地流行的兔皮肤真菌病是我国当前危害养兔业最为严重的皮肤病，发病率可达30%～95％，发病死亡率可达10%～30％，各地兔场均有发生，各品种兔均能发病，兔场一旦感染，由于该病的顽固性，便很快传遍整个兔场，严重影响其生长性能及皮毛的质量，从而影响养殖者的经济效益。为此，很多学者开展了对该病的研究，取得了很大的进展，但仍然有许多问题拯待解决，其中病原方面的，由于其直接暴露于空气中，因此病原复杂，到底是单一的病原真菌还是多病原感染，因此需要一种能及时快速作出诊断的方法，为此我们根据分离的病原真菌中，在培养特性等表型方面作出初步鉴定的基础上，设计了引物，进一步建立了PCR快速诊断技术，能够快速、正确的作出诊断，为该病提供相应的防治技术奠定基础。 1 材料和方法1.1 皮肤真菌病病原分离鉴定1.1.1 皮肤真菌病原分离 赴浙江省的建德、宁波、临海、嵊州、新昌、嘉善、桐乡及江苏等地发病的兔场，对发病的獭兔、肉兔、长毛兔等病兔在病变部位采用酒精消毒，在病健交界处用消毒眼科镊子夹取结痂的皮屑置于TSA培养基上，于28℃、湿度75％的真菌恒温培养箱中培养，5～7天后观察结果，并据培养情况进一步分离纯化。 （2）分离病原真菌表型初步鉴定 分离纯化培养后，观察菌落的形态、大小、色彩；进而在显微镜下观察菌体、菌丝、孢子的形态特征，明确其培养特性、生长特性、形态特征等表型特征，初步鉴定出其种类。 2 皮肤真菌病PCR快速诊断技术用TSA培养基培养分离鉴定的病原真菌，在真菌恒温培养箱中培养3－5天后，用液氮法提取基因组DNA，根据相关霉菌已知的基因序列设计ITS引物，采用PCR技术扩增出分离菌的基因，优化基因组DNA提取和基因扩增条件，建立起皮肤真菌病PCR快速诊断技术。 2.1 真菌基因组DNA提取方法在TSA培养基上培养分离鉴定的病原菌，在真菌恒温培养箱中培养3－5天后，用无菌接种环从固体培养基上挑取菌苔于研钵中，加入少量液氮，用研磨棒稍加研磨，然后在研钵中加入1mL 10%（w/v）的Chelex-100 溶液，在旋涡混合器上振荡5s，沸水浴10min，冷却至室温后12,000r/min离心15min，转移上清置于-20℃冻存备用，上清即可作为 PCR的模板。 2.2 引物设计根据基因库已知的序列设计以下通用引物： TCCGTAGGTGAACCTGCGG ITS1 5’-3’ TCCTCCGCTTATTGATATGC ITS4 5’-3’ 2.3 rDNA-ITS PCR反应体系及操作程序50 μl 反应体系：2 μl DNA原液，25 μl 2×EasyTaq PCR Super Mix 溶液，引物各2 μl（20umol/L），ddH2O19 μl。反应在PE-9600 型PCR 仪上进行，程序为：95℃变性 3min；94℃变性1min，55℃复性 1min，72℃延伸 1.5min；进行35 个循环，72℃延伸10min。反应完成后，取5 μlPCR 产物在 2%琼脂糖凝胶100V 电泳，260nm 紫外灯下观察结果，并对PCR产物送检测序。 3 结果3.1 皮肤真菌病病原分离及表型初步鉴定结果在浙江省的建德、宁波、临海、嵊州、新昌、嘉善、桐乡及江苏等发病的21个兔场中，分别从肉兔、獭兔、长毛兔等各品种病兔中分离到真菌17株，分属于须癣毛癣菌10株、犬小孢子菌5株和趾间毛癣菌2株。其中分离到最多的致病菌是须癣毛癣菌（又称石膏样毛癣菌），几乎每个兔场中均能分离到，其次为犬小孢子菌和趾间毛癣菌。见图1。 3.1.1 须癣毛癣菌表型特征 须癣毛癣菌表型特征主要为：恒温箱中培养72h后，TSA琼脂上能看到培养基表面长出雪花状菌落，至第6天长出霉菌样菌落。菌落大小直径约0.5～lcm，呈不规则形态，菌落顶部呈白色粉末状，菌落扁平微隆起，边缘呈辐射状向外生长；菌落背面呈棕褐色；菌落下层致密，质地较硬。 用接种环挑取菌落，置于少许生理盐水的玻片上，于显微镜下观察，可见多量的菌丝和孢子，有的成串，呈粟粒样；菌丝细长有节，有的呈螺旋状，菌丝上有小梗；小分生孢子多量，单个或成丛，形态近乎圆形或椭圆形；大分生孢子很少。根据这些表型特征，初步鉴定为须癣毛癣菌。 3.1.2 犬小孢子菌表型特征 犬小孢子菌表型特征主要为：恒温箱中培养72小时后，TSA琼脂上能看到培养基表面长出雪花状的菌落，至第6天长出大菌落，生长非常迅速，菌落直径大于5cm，呈不规则圆形，菌落中部比周边低，周边蓬松上翘，并呈羽毛飘逸状往周边生长，正面呈白色羽毛状；菌落背面也呈白色。根据菌落的表型特征，初步鉴定为犬小孢子菌。 3.1.3 趾间毛癣菌 TSA培养基上28℃、湿度75％的真菌恒温培养箱中培养，5～7天后观察菌落，大小直径约0.5～lcm，呈规则圆形，馒头状隆起，菌落顶部孢子呈粉红色粉末状，与周边色差分明，个别菌落上掺杂着黑色孢子的颜色；菌落周边主要为菌丝，呈白色；菌落背面呈白色；根据菌落的表型特征，初步鉴定为趾间毛癣菌。 由上可见，虽然能从菌落的大小、生长形态、颜色等基本表现作出初步判断，但由于有些真菌的生长形态等表型特征非常相似，相互间很难作出正确的区分，因此要作出正确的鉴定，必须从分子生物，特别是采用PCR的技术，对分离菌作出最终的鉴定。 4 兔皮肤真菌病原菌PCR快速诊断技术用TSA培养基培养已分离纯化的病原真菌，在真菌恒温培养箱中培养3－5天后，用接种环无菌挑取菌苔于研钵中，用液氮法提取基因组DNA，根据设计的通用引物ITS及相应的PCR操作程序，对根据表型初步鉴定的3种真菌进行PCR扩增，结果见图2。 收集扩增后的产物送检生物公司进行测序，结果如下图3： 根据测序结果表明，大小分别为692bp、741bp和708bp，通过基因Bank的BLAST软件进行比对，结果表明分别为须癣毛癣菌、犬小孢子菌和趾间毛癣菌。再与表型鉴定相结合，作出相应的鉴定结果，分别为须癣毛癣菌10株、犬小孢子菌5株和趾间毛癣菌2株。 研究结果表明，建立的PCR技术能够快速、敏感、准确地鉴定出兔皮肤真菌病原菌。 5 结论和讨论根据以上结果，分离鉴定的兔皮肤真菌病病原菌，在培养纯化后，从形态、生长特性、色泽、大小等表型特征作出初步的判断，但由于真菌种类繁多，空气中本身就有很多非病原真菌的存在，而且很多病原真菌在形态等表型特性上很相似，单凭表型特征很难进行区分，如须癣毛癣菌和趾间毛癣菌，菌落形态非常相似，无法区分，因此必须采用分子生物学的技术手段才能作出正确的鉴定，本文建立的PCR诊断方法能有效鉴别出须癣毛癣菌、犬小孢子菌和趾间毛癣菌，基因片段大小分别为692bp、741bp和708bp。 从浙江、江苏等省的21个兔场中共分离出17株菌病原真菌，通过表型判断及PCR鉴定结果，共鉴定出须癣毛癣菌10株（又称石膏样毛癣菌）、犬小孢子菌5株和趾间毛癣菌2株。这个结果与各地学者报道的基本一致，感染最多的是石膏样毛癣菌，几乎每个兔场、不同的品种中均能分离到该菌，说明其是主要致病菌，但分离鉴定的其它几种菌，如犬小孢子菌、趾间毛癣菌报道的很少，其致病性的强程度有待进一步的人工发病试验，以证实其致病性及毒力。 建立的PCR检测方法能有效鉴定不同的菌属种类，因此建立的方法是一种准确、快速、敏感的诊断方法。由于真菌孢子的壁比较硬，用常规提取细菌DNA的方法可行性比较差，我们尝试过用超声等提取基因组的方法，结果都不理想，后来改用液氮预处理的方法，结果表明效果良好。
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