|
基于液质联用技术的连翘化学成分分析 张晨曦 1, 3，刘素香 2，赵艳敏 1, 3，张铁军 2，刘岱琳 3* 1. 天津中医药大学，天津 300193 2. 天津药物研究院，天津 300193 3. 中国人民武警警察部队后勤学院，天津 300309
摘 要：目的 应用液质联用技术在正负离子模式下分析连翘Forsythiae Fructus中的主要化学成分。方法 采用Agilent 1200 HPLC，Diamonsil II C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以 0.05%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）为流动相，梯度洗脱，体积流量为 1.0 mL/min，柱温 35 ℃，进行 200～600 nm 全扫描，建立连翘指纹图谱，同时结合 Bruker Daltonics 的 1200 HPLC-Q-TOF 给出的正、负离子质谱信息和元素分析，与相关文献数据对照，分析化合物信息。结果 结合 HPLC-Q-TOF-MS 提供的化合物准确相对分子质量，鉴定连翘中 24 个化合物，有 12 个苯乙醇苷类成分、7 个木脂素类成分、5 个黄酮类化合物，其中有 5 个化合物：3,4-二羟基苯乙醇苷（1）、2-甲氧基-3,4,5-三羟基苯乙醇苷（2）、β-羟基化连翘酯苷 H（7）、6-羟基 二氢黄酮（24）、二氢杨梅素（25）为首次从连翘中得到鉴定。结论 为连翘药材的质量控制提供技术支持，为阐明连翘的药效物质基础提供数据参考。 关键词：连翘；液质联用技术；苯乙醇苷类；木脂素；黄酮；3,4-二羟基苯乙醇苷；β-羟基化连翘酯苷 H；二氢杨梅素
中图分类号：R284.1 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)12 - 2053 - 08 DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.12.006
Analysis on chemical constituents from Forsythiae Fructus by HPLC-Q-TOF-MS ZHANG Chen-xi1, 3, LIU Su-xiang2, ZHAO Yan-min1, 3, ZHANG Tie-jun2, LIU Dai-lin3
1. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China 2. Tianjin Pharmaceutical Research Institute, Tianjin 300193, China 3. College of Logistics, University of People’s Armed Police Force, Tianjin 300309, China
Abstract: Objective To analysis the main chemical ingredients of Forsythiae Fructus by LC-MS technology in the positive and negative ions mode. Methods The chromatographic fingerprint was obtained with Diamonsil II C18 column (250 mm × 4.6 mm, 5μm) and gradient elution with 0.05% H2O-formic acid (A)-acetonitrile (B), and the flow rate was 1.0 mL/min. The column temperature was maintained at 35 ℃. The detection wavelength was 200?600 nm. Positive and negative ions MS information of Bruker Daltonics 1200 HPLC-Q-TOF was coupled with elemental analysis and compared with literature data to analyze the compounds information. Results Combined with the accurately relative molecular mass of compounds provided by HPLC-Q-TOF-MS, 24 compounds were identified from the ethanolic extraction of Forsythia Fructus, which include 12 phenylethanoid glycosides, seven lignan ingredients, and five flavonoids. And 3,4-dihydroxyphenylethanoid glycoside (1), 2-methoxy-3,4,5-trihydroxyphenylethanoid glycoside (2), β-hydroxyforsythoside H (7), dihydroquercetagetin (24), and dihydromyricetin (25) were first identified in Forsythiae fructus. Conclusion The method provides the technical support for the quality control of Forsythiae Fructus and contributes the reference data to elucidating the potential basis of Forsythiae Fructus. Key words: Forsythiae Fructus; LC-MS technique; phenylethanoid glycosides; lignin; flavonoids; 3,4-dihydroxyphenylethanoid glycoside; β-hydroxyforsythoside H; dihydromyricetin 连翘 Forsythiae Fructus 为常用中药，也是疏风解毒胶囊原料药材之一，具有清热解毒、散结消肿的功效，中医临床称之为“疮家圣药”，用于风热感冒、温病、丹毒、热淋尿闭、痈疽、凛病和肿毒等症的治疗[1]，并对急性肾炎、肺结核、视网膜黄斑区出血、呃逆、便秘等有一定的治疗作用，具有广泛的临床应用基础[2]。现代研究表明，连翘果实中主要含有木脂素类、苯乙醇苷类、黄酮类、挥发油及萜类、生物碱类和有机酸类等化学成分，其中苯乙醇苷类、木脂素类和黄酮类成分为其主要有效成分[3]。 目前针对连翘的研究多集中在连翘的化学成分、质量标准和药理作用等方面。随着药理作用研究的不断深入，其药效物质基础的快速分析鉴定更是需要关注的方面。液质联用技术在化学成分研究中的应用已显优势，是中药药效物质基础研究的有力手段。曾建勋等[4]利用 HPLC-TOF-MS 分析连翘水煎液，鉴定了其中 9 个色谱峰，主要是苯乙醇苷类成分和黄酮类成分；刘影等[5]利用 NMR/LC-MS 平行动态谱学方法技术对连翘提取物中苯乙醇苷类成分进行了同步结构分析研究，鉴定出 7 种成分， 其中包括 1 个新的苯乙醇苷和 1 个结构极其罕见的二聚苯乙醇苷生物碱。本实验优化了 HPLC 分析条件，利用 HPLC-Q-TOF 技术分析了连翘提取物的 25 个色谱峰，首次通过色谱和质谱结合一次性识别了 24 个化合物的结构，其中有 5 个化合物：3,4-二 羟基苯乙醇苷（1）、2-甲氧基-3,4,5-三羟基苯乙醇苷 （2）、β-羟基化连翘酯苷 H（7）、6-羟基二氢黄酮 （24）、二氢杨梅素（25）为首次在连翘中发现，本 研究为更有效地确定连翘的药效物质基础，提升质量标准提供了技术支撑。 1 仪器与试药 1200 HPLC-TOF/MS（Bruker Daltonics），1200 HPLC（Agilent Technology） ，Milli-Q 超纯水系统（法国Millipore公司）。甲醇和乙腈（色谱纯，美国Merck 公司），对照品连翘酯苷A（批号 111810-201102）和连翘苷（批号 110821-200711）购自中国食品药品检定研究院，槲皮素（批号6151-25-3）购自南京泽朗 医药科技有限公司，连翘酯苷 I（批号KMST-L014）、连翘酯苷 H（批号KMST-L013）、( )-表松脂素-4-O- β-D-葡萄糖苷（批号KMST-B021）、( )-松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷（批号 KMST-S012）和芦丁（批号 KMST-L020）购自天津市科曼思特医药科技发展有限公司，质量分数均大于 98%。 药材购自安国药材市场，由天津药物研究院中药研究室张铁军研究员鉴定为连翘 Forsythia suspense (Thunb.) Vahl 的干燥果实。 2 方法 2.1 对照品溶液的制备 精确称量连翘酯苷 A、连翘酯苷 I、连翘酯苷 H、连翘苷、( )-表松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷、( )-松脂 素-4-O-β-D-葡萄糖苷、芦丁和槲皮素对照品各2.00 mg，分别置于 10 mL量瓶中，加入适量50%甲醇溶解，并以50%甲醇定容，得到质量浓度为 200μg/mL 的各单体对照品贮备液。检测前再将对照品贮备液用50%甲醇稀释 10 倍，经 0.22μm 微孔滤膜滤过，取续滤液备用。 2.2 供试品溶液的制备 取连翘药材粉末 1 g 置于 100 mL圆底烧瓶中，加入 70%甲醇 25 mL 称定质量，回流提取30 min，放冷，称定质量，并用 70%甲醇补足减失质量，摇匀。经 0.22μm 微孔滤膜滤过，取续滤液备用。 2.3 分析条件 2.3.1 色谱条件 色谱柱为 Diamonsil II C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为 0.05%甲酸水溶液乙腈溶液，梯度洗脱：0～15 min，5%～15% B；15～ 65 min，15%～40% B；65～80 min，40%～100% B；80～85 min，100% B。体积流量为 1.0 mL/min；柱温 35 ℃；200～600 nm 全扫描；进样量为 5μL。 2.3.2 质谱条件 采用正、负离子 2 种模式扫描测定，电喷雾离子源（ESI），扫描质量范围 m/z 50～ 1 200；毛细管电压 4.5 kV（正离子），2.6 kV（负离子），碎裂电压 200 V；干燥气温度为 180 ℃；干燥气的体积流量为 6 L/min，雾化气压为 80 kPa；分流 比为 1∶4；内标校正选用甲酸钠溶液。 3 结果 3.1 连翘中化学成分分析 采用HPLC-Q-TOF-MS正负离子模式分析连翘 70%甲醇提取物中的化学成分，( ) ESI-MS、(?) ESI-MS 的质谱总离子流图（TIC）见图 1。通过 HPLC-Q-TOF-MS检测得到了连翘中25个化合物的保留时间和质谱数据信息，结合 HPLC 反映化合物的极性、离子流质谱数据和相关文献报道数据对比分析，确定了 12 个苯乙醇苷类成分、7 个木脂素类成分和 5 个黄酮类成分，有 1 个色谱峰未识别。分析结果见表 1。 3.2.1 苯乙醇苷类化合物的分析鉴定 苯乙醇苷类成分是连翘药材中的特征性成分，本研究中共分析鉴别了 12 个苯乙醇苷类化合物的结构，其结构如图 2 所示，连翘的液质分析图谱中 12 个苯乙醇苷类化合物，表现出了相似的裂解规律，如丢失 rhamnose （MW 146）、H2O（MW 18）、caffic acyl（MW 162） ， 这类化合物都存在很多相似的裂解碎片峰，如 MW 479、325、163 等。
质谱中 3 号峰信号通过正离子 m/z 483 [M＋ Na] 和负离子 m/z 461 [M－H]?分析确定化合物的相对分子质量为 462。与 10 号峰相比，相对分子质量给出未连接咖啡酰基的信息，质谱裂解碎片中未见到 163 的特征峰，只观察到脱去 1 分子鼠李糖基片段 m/z 317 和再脱去 1 分子葡萄糖基片段的苯乙醇片段碎片 m/z 155，结合文献报道的数据和化合物的极性确定 3 号峰为连翘酯苷 E[6]。 9、12 号色谱峰与 10 号峰的相对分子质量信息以及质谱裂解规律完全相同，仅出峰时间不同，存在一定的极性差异，说明 9、12 号色谱峰应该为连翘酯苷 A 的同分异构体，仅是咖啡酰基在葡萄糖基上的连接位置不同而存在微弱的极性差异。通过文献调研连翘中报道连翘酯苷A的同分异构体有连翘酯苷 I 和连翘酯苷 H，在相同的质谱条件下 9 号色 谱峰的质谱信息与对照品连翘酯苷 I 的裂解规律和出峰时间相一致，12 号色谱峰的质谱信息与对照品连翘酯苷 H 的裂解规律和出峰时间相一致，从而确 定 9 号峰为连翘酯苷 I，12 号峰为连翘酯苷 H。 5、6、7 号色谱峰的质谱数据分析，正离子 m/z 663 [M＋Na] 和负离子 m/z 639 [M－H]?分析确定 这 3 个化合物的相对分子质量都是 640，也是 1 组同分异构体。且相对分子质量与 10 号峰相比多出 1 个酚羟基。同时 3 个色谱峰对应的质谱裂解信息中都可以观察到丢失 1 分子水（m/z 18）的信息，可以确定这 3 个化合物是连翘酯苷 A 及其同分异构体的羟基化产物。通过文献比对并参考 9、10、12 号峰的结构鉴定过程，推测 5 号峰为连翘酯苷 C，6 号峰为羟基化连翘酯苷 A[6-7]，7号峰为羟基化连翘酯苷 H。 8 号峰通过正离子m/z 633 [M＋Na] 和负离子 m/z 609 [M－H]?分析确定化合物的相对分子质量为610。与10号峰相比优先丢失的碎片为xylose m/z 132 的碎片，其他裂解规律均与连翘酯苷 A 相同，检索文献报道[3]发现连翘中含有连翘酯苷 J，其分子式为 C28H34O15，相对分子质量理论值为 610.189 8，实测值为 633.184 2 [M＋Na] ，且对比二者极性相当，确定 8 号峰为连翘酯苷 J。 13 号峰通过正离子 m/z 645 [M＋Na] 和负离子m/z 621 [M－H]? 分析确定化合物的相对分子质量为 622。与 10 号峰的裂解规律相比其裂解碎片中只有苯乙醇碎片部分出现了差异，说明该部分结构发生了变化，是苯乙醇链部分和糖基部分发生了环合，连翘中报道过的化合物 suspensaside A[6]。该化合物的分子式为 C29H34O5，相对分子质量理论值为 622.189 8，实测值为 645.179 1 [M＋Na] 。其裂解规律和极性都符合，因此推测 13 号峰为连翘梾木苷 A。 4 号峰通过正离子 m/z 489 [M＋H] 和负离子 m/z 487 [M－H]? 分析确定化合物的相对分子质量为 488。其结构与 10 号峰相比较，缺少了 1 个鼠李糖基片段，同结构中没有 m/z 152 的苯乙醇基结构碎片而是出现了 1 个 m/z 164 的裂解碎片，这是香豆酰基的结构片段。对比文献鉴定其与 p-coumaroyl-(6-O-caffeoyl)-glucoside 的裂解规律相符合，且该化合物的分子式为 C24H24O11，相对分子质量理论值为 488.131 9，实测值为 489.140 3 [M＋ H] ，因此推测 4 号峰为对-香豆素-(6-O-咖啡酰基)葡萄糖苷。 此外 1 和 2 号峰为 2 个小分子苯乙醇苷类化合物。1 号峰通过正离子 m/z 339 [M＋Na] 和负离子 m/z 315 [M－H]? 分析确定化合物的相对分子质量为 316。2 号峰通过正离子 m/z 399 [M＋Na] 和负离子 m/z 375 [M－H]? 分析确定化合物的相对分子质量为 376。 1 号峰和 2 号峰的质谱裂解规律中都有脱去 1 个 m/z 162的碎片，推测结构中都是直接连接 1 个葡萄糖基，苯环上取代基有相应的变化，结构比较简单，极性较大，根据文献和质谱数据对比，1 号峰的分子式为 C14H20O8，相对分子质量理论值为 316.115 8，实测值为 339.112 2 [M＋Na] ，因此推测 1号峰为 3,4-二羟基苯乙醇苷。2 号峰的分子式为 C16H24O10，相对分子质量理论值为 376.137 0， 实测值为 399.128 5 [M＋Na] ，推测 2 号峰为 2-甲 氧基-3,4,5-三羟基苯乙醇苷。 3.2.2 木脂素类化合物的分析鉴定 木脂素类是连翘药材中的另一类重要功效成分。到目前为止，从连翘属植物中已分离得到34个木脂素类化合物[8]，根据其结构特点，分为双并四氢呋喃类、丁烷衍生物类、四氢呋喃类和芳基四氢萘类 4 类木脂素。量相对较高的木脂素类成分是连翘苷、( )-表松脂素- 4-O-β-D-葡萄糖苷和 ( )-松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷成分。本实验利用 HPLC-Q-TOF-MS 技术共识别了 7 个木脂素类化合物（图 4），且 7 个都是双并四氢呋喃类木脂素。 19 号峰通过正离子 m/z 557 [M＋H] 和负离子 m/z 533 [M－H]? 分析确定化合物的相对分子质量为 534。质谱中有脱去 1 个葡萄糖基 m/z 162 的裂解碎片。 而 21 号峰与 19 号峰相比较，仅丢失了 1 分子葡萄糖基碎片，是其苷元连翘脂素的结构，其分子式为 C21H24O6，相对分子质量理论值为 372.157 3， 实测值为 373.155 8 [M＋H] ，因此 21 号峰为连翘 脂素。 14、15 和 16 号峰通过正负离子数据对照，确定相对分子质量 520，且三者的裂解规律完全相同， 说明这 3 个峰为 3 个同分异构体的结构，与 19 号峰相比较丢失了m/z 14，为其羟基化产物。14 号和 15 号峰在相同的质谱条件下分别与对照品 ( )-表松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷、( )-松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷的裂解规律和出峰时间相一致，确定 14 号和 15 号峰分别为 ( )-表松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷和 ( )-松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷。而化合物 16 是它们的同分异构体，分子式为 C26H32O11，相对分子质量理论值为 520.194 5，实测值为 543.184 3 [M＋Na] ，参考文献报道[6]推测可能为 ( )-表松脂素-4′-O- β-D-葡萄糖苷。 3.2.3 黄酮类化合物的鉴定 本实验中利用 HPLC-Q-TOF-MS 共识别了 5 个黄酮类化合物（图 5），涵盖了黄酮醇、黄酮和二氢黄酮的结构母核。在本液相分析条件下只观察到了 1 个黄酮苷结构， 即芦丁，其他 4 个均为黄酮苷元的结构。11 号峰通过正离子 m/z 611 [M＋Na] 和负离子 m/z 609 [M－H]?分析确定化合物的相对分子质量为 610。其质谱裂解过程中可以观察到脱去了 1 分子鼠李糖基 m/z 146 和 1 分子葡萄糖基 m/z 162，苷元碎片 m/z 303。 其在相同的质谱条件下与对照品芦丁的裂解规律和出峰时间相一致，从而确定 11 号峰为芦丁。而 23 号峰通过正离子 m/z 303 [M＋H] 和负离子 m/z 301 [M－H]?分析确定化合物的相对分子质量为 302。这与芦丁苷元的碎片裂解规律相一致，在相同的质谱条件下与对照品槲皮素的裂解规律和出峰时间相一致，因此确定 23 号峰为槲皮素。22 号峰极性大于 23 号峰，其正离子 m/z 357 [M＋H] 和负离子 m/z 333 [M－H]? 分析确定相对分子质量 334。且质谱 裂解规律显示其可以脱去m/z 32获得槲皮素的碎片峰，推测 22 号峰是在槲皮素基础上连接 2 个羟基的结构，根据槲皮素结构并通过文献检索[9]确定 22 号峰为 3′,6-二羟基槲皮素。
4 讨论 本实验采用 HPLC-Q-TOF-MS，利用质谱的高分辨率特点分析了连翘药材的70%甲醇提取物中存在的化学成分，根据正负离子模式下准分子离子峰，再结合各个化合物的裂解规律，并与对照品在相同质谱条件下进行比对，确定 8 种化合物：连翘酯苷 I（9）、连翘酯苷 A（10）、芦丁（11）、连翘酯苷 H （12）、( )-松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷（14）、( )-表松脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷（15）、连翘苷（19）和槲皮素（23）；由准确的相对分子质量及元素组成分 析并结合文献报道推测出16种化合物，分别为：3,4二羟基苯乙醇苷（1）、2-甲氧基-3,4,5-三羟基苯乙醇苷（2）、连翘酯苷 E（3）、对-香豆素-(6-O-咖啡酰基)-葡萄糖苷（4）、连翘酯苷 C（5）、β-羟基化连翘 酯苷 A（6）、β-羟基化连翘酯苷 H（7）、连翘酯苷 J（8）、连翘梾木苷 A（13）、( )-表松脂素-4′-O-β-D葡萄糖苷（16）、连翘苷异构体（17）、羟基连翘脂素（20）、连翘脂素（21）、3′,6-二羟基槲皮素（22）、 6-羟基二氢黄酮（24）、二氢杨梅素（25）。其中化合物 1、2、7、24、25 为首次从该植物中报道。从总离子流和正负离子模式下分析，还有一些量较少的色谱峰。推测可能为有机酸类成分，但其裂解规律有待进一步研究。 本实验采用HPLC-Q-TOF-MS技术对连翘果实药材提取物中的化学成分进行了分析，鉴定了 12 个苯乙醇苷类成分、7 个木脂素类成分、5 个黄酮类化合物，为其饮片的质量控制，以及后续阐明连翘药材的物质作用基础提供了详实的数据支撑。
参 考 文 献 [1] 中国药典 [S]. 一部. 2015. [2] 赵建平, 张 玲, 王世伟. 连翘临床新用简介 [J]. 山西中医, 2004, 20(6): 53. [3] 陈 玲, 李 晓, 李 倩, 等. 连翘属植物化学成分的研究进展 [J]. 现代药物与临床, 2013, 28(3): 441-445. [4] 曾建勋, 马龚斌, 李瑞明, 等. 高效液相色谱飞行时间质谱分析连翘水煎液的有效成分 [J]. 中药材, 2013, 36(4): 581-583. [5] 刘 影. 苯乙醇苷类化合物及其混合物组分群的质谱分析方法以及 LC-MS/NMR 相关谱分析方法研究 [D]. 北京: 中国协和医科大学, 2009. [6] 王福男. 中药连翘的化学成分研究 [D]. 北京: 中国协和医科大学, 2009. [7] Guo H, Liu A H, Li L, et al. Simultaneous determination of 12 major constituents in Forsythia suspense by high performance liquid chromatography-DAD method [J]. Pharm Biomed Anal, 2007, 43(3): 1000-1006. [8] 冯 锐. 一种连翘总苷的提取纯化工艺研究 [D]. 成都: 西南交通大学, 2014. [9] Estrada E, Quincoces J A, Patlewicz G. Creating molecular diversity from antioxidants in Brazilian propolis. combination of TOPS-MODE QSAR and virtual structure generation [J]. Mol Divers, 2004, 8(1): 21-33. [10] Piccinelli A L, De Simone F, Passi S, et al. Phenolic constituents and antioxidant activity of Wendita calysina leaves (Burrito), a folk paraguayan tea [J]. Agric Food Chem, 2004, 52(19): 5863-5868. [11] Roschek B J, Fink R C, McMichael M D, et al. Elderberry flavonoids bind to and prevent H1N1 infection in vitro [J]. Phytochemistry, 2009, 70(10): 1255-1261.
|
|
|
