【听课笔记】细菌性腹泻的临床实验室诊断操作规范

主要内容

1、细菌性腹泻的实验室诊断临床意义

2、便标本采集方法

3、便标本运送、接收、拒收标准

4、实验室检查操作程序

5、菌株鉴定及抗菌药物药敏试验

6、毒素、抗原检测

7、结果分析原则及报告程序

8、质控

9、分析后环节：报告的解释与会诊

  细菌性腹泻：

以腹泻为主要表现的一组常见肠道传染病，细菌性肠胃炎在发达地区及发展中国家多很普遍，每年全球有近1.7亿例腹泻病例，腹泻也是导致5岁以下儿童营养不良的原因之一，死亡的第二原因，每年因腹泻死亡的5岁以下儿童约76万。大部分细菌性胃肠炎都是自限性的，并且是可以预防和治疗的，注意饮水安全，适当的卫生设施和清洁来预防。

常见病原菌

沙门菌属某些种、志贺菌属、气单胞菌属、弯曲菌、耶尔森菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、艰难梭菌和霍乱弧菌等。

细菌性腹泻的实验室诊断

细菌性腹泻的诊断，常见的诊断方法为大便培养；也有快速诊断方法，比如：抗原检测、PCR、质谱技术等，在艰难梭菌、产志贺毒素大肠埃希菌、弯曲杆菌的鉴定方面可以做到快速诊断。

引起食物中毒的肠道病原菌：蜡样芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌等，要求微生物实验室应配备相应的设备及专业技术人员，快速、准确诊断病原菌；

从微生物标本采集，细菌培养、分离、形态学检查、鉴定和药敏试验流程以及质量控制，包括及时报告并给予正确的结果解释。在临床实验室很少检测，当地CDC可作为疫情调查，采集粪便、食物、呕吐物标本进行检查。

标本运送原则：

    运送时间：1小时以内，最长不超过2小时，延长运送，需要使用运送培养基，保证运送温度和储存温度，特殊细菌的运送要及时、保温。标本采集、运输和储存需要注意生物安全，无菌操作、密闭运输，可以使用密闭塑料袋，防漏容器。

实验室各环节可能接触3种危险病原菌：

伤寒、副伤寒沙门菌、产细胞毒素大肠埃希菌（O157）或志贺氏菌。实验室获得性感染时常有报道，所需的感染剂量非常低，实验室操作过程中可产生传染性气溶胶，所以全部操作必须在生物安全柜内进行。

标本采集

1、自然排便法：患者在清洁的便盆内排便，用竹签挑取脓血或粘液部分2-3g，若为液体，液体粪便取絮状物2-3ml。

2、直肠拭子法：此法不如粪便敏感，用于患者腹泻但暂时没有大量粪便的患者、婴幼儿（尤其是检测患有腹泻或溶血性尿毒综合症的婴幼儿）。

具体方法为：无菌拭子蘸取生理盐水湿润，由肛门插入约6-7cm，轻轻在直肠内旋动取出大便少许，肉眼可见，将拭子送入运输培养基加盖封口送检。

3、疑似伤寒病例，发热的第一周，最好采集血液或骨髓标本，随后的几个星期，可以采集粪便和尿液。

标本运送

运送时间：

1、非运送培养基：采集后2小时内送到实验室并处理（沙门菌对二氧化碳敏感，不得超过2小时），推荐使用转运培养基，可以4℃保存，24小时内送到实验室。常用的转运培养基未Cary-Blair转运培养基，不用无菌棉签，因含消毒成本，对细菌有抑制。

2、标识清楚：患者基本信息、检查项目（明确建议分离何种细菌）、标本类型及性质、标本采集时间、申请医师姓名等。

3、便细菌培养，在国际上通常做筛选沙门、志贺和弯曲菌；而国内通常分离沙门、志贺为目标菌。

注意事项

1、尽可能在使用抗生素之前收集标本；

2、推荐在感染急性期采集标本（通常是腹泻5-7天内）；

3、不接触其他部位，不可混入尿液及其他异物，尽量无菌操作；

4、不要用厕纸收集粪便（吸收水分、粘附有效成份）；

5、厌氧培养需要用带盖塑料试管留取2/3量以上；

6、不建议同一病人在同一天重复送检；

7、肠炎和发热病人建议做血培养。

标本接收与拒收

1、收到合格标本后立即培养处理，

2、收到不合格标本，与临床医师联系，注明拒收原因并退回，可要求重新留取标本，并做好记录，

3、在没有与医师沟通之前，标本不可丢弃。

标本拒收标准

1、采集2小时候但没有使用转运培养基运送的标本；

2、以转运培养基送检，但4℃超过48小时，或35℃超过24小时的标本；

3、若上述两种情况标本不能重新送检，应在报告单上标记“标本运送延迟，培养可能出现假阴性”。

4、干燥的拭子；

5、含钡粪便；

6、黄软成形便、硬便；

7、以寄生虫为检测目的，而用转运培养基运送的标本；

8、住院患者违反三日规则。

艰难梭菌检测标本拒收标准：

1、不应检测无症状患者（排成形便）、高定值率的患者人群（感染治疗成功后有定值存在、一岁以下婴儿定值率高）；

2、不推荐或禁止阴性标本的重复测试，一些研究表明，对于CDI，无论何种方法，重复检测价值很低。

三日规则（three-day rule）：

   住院3天内出现的腹泻，可能是抗生素相关性腹泻（艰难梭菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌），不建议做普通细菌培养。

   腹泻病原菌检测（除了艰难梭菌），门诊和住院不超过3天的患者，不包括HIV患者、严重中性粒细胞减少患者、疑似肠道感染但非腹泻表现患者、疑似院内爆发、某些情况下的儿科患者。

培养基及鉴定程序

 以下鉴定程序来自北京协和医院检验科起草的“细菌性腹泻的临床实验室诊断操作规范”课件，点击图片即可放大查看。

其他腹泻病原菌鉴定：

1、芽孢杆菌：疑似炭疽芽孢杆菌时，如菌落不溶血且动力阴性，应上报CDC进行确认；

2、霍乱弧菌：经碱性蛋白胨增菌6小时，转种到TCBS24-48小时培养，庆大霉素培养基O/129纸片敏感性检测、血清凝集试验，若疑似霍乱弧菌则上报CDC进行确认；

3、大肠埃希菌O157：H7鉴定：SMAC-BAP-O157乳胶凝集、H7鞭毛抗血清-凝集试验阳性，送至CDC进行确认。

4、艰难梭菌的鉴定：CCFA：厌氧培养48-72小时，革兰阳性杆菌，很少形成芽孢，直径约4mm，灰白色，带白色中心；经紫外线照射可产生荧光，有典型恶臭味。

其次，检测毒素A、B：酶免疫法、免疫层析法，实时荧光定量PCR测毒素基因tcda、tddB。

5、弯曲菌属鉴定：革兰氏染色镜检，革兰阴性小杆菌，弯曲成螺旋形、弓箭型、逗点型、海鸥展翅型等；球形，尤其是陈旧的、长时间放置于空气中的培养物涂片。湿片法镜下观察细菌运动，螺旋式运动。

结果报告

一、培养阴性：

    如果检测沙门菌、志贺氏菌及空肠弯曲菌，则报告：“沙门氏菌、志贺氏菌及空肠弯曲菌培养阴性”。若培养排出了某些特定致病菌，在结论中列出该致病菌培养阴性，如“O157大肠埃希菌、弧菌、耶尔森菌或气单胞菌培养阴性”。

二、培养阳性：

1、沙门氏菌属的报告：

    根据抗血清凝集结果报告：伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌或沙门氏菌血清群A/C/D；若检测出沙门氏菌属其他种，则具体报告种名。

2、霍乱弧菌的报告：

血清群（O1或非1）,O1群则按血清型进行分类，小川型、稻叶型、彦岛型，生物性（古典型和ELTor）。

3、弯曲菌属的报告：

标本直接涂片革兰染色镜检，看到翼状、弯曲、革兰阴性的杆菌，报告“疑似弯曲杆菌属”；湿片法观察到投镖式或螺旋式运动动力特性，也可报告“疑似弯曲杆菌属”；鉴定出最终鉴定结果（空场弯曲菌或弯曲杆菌属）。

4、以下几个结果阳性通知当地CDC：霍乱弧菌、弯曲杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、炭疽芽孢杆菌属。

药敏试验

   细菌性胃肠炎在健康儿童和成人中是自限性疾病，不用常规报告药敏试验结果，但以下几种临床情况除外：

1、医生要求；

2、患者为播散性感染；

3、伤寒沙门菌感染；

4、志贺菌感染；

5、小于一岁和大于65岁的沙门菌感染者；

6、免疫缺陷患者，包括HIV患者和人免疫缺陷病毒感染。

    志贺氏菌、沙门氏菌、气单胞菌、邻单胞菌、爱德华氏菌、弧菌以及耶尔森氏菌的药敏试验：

1、仅肠内感染时，报告氨苄西林、甲氧苄啶-磺胺甲恶唑和喹诺酮类药敏；

2、有侵袭性感染的病人，存在多重概念耐药菌时，同时报告第三代头孢菌素；

3、霍乱弧菌同时应报告多西环素或四环素；

4、沙门氏菌和志贺氏菌第一、二代头孢菌素及氨基糖苷类不报告药敏结果；

5、由于喹诺酮类抑制骨骼生长，故14岁以下儿童不选用喹诺酮类。

弯曲菌属药敏试验：

1、首选环丙沙星、红霉素以及新型大环内酯类；

2、红霉素和环丙沙星药敏纸片周围细菌生长减弱，提示所测试的菌株可能具有耐药性；折点参照：CLSI-M45。

    O157型大肠埃希菌或肠出血性大肠埃希菌不用报告药敏结果。抗生素治疗出血性结肠炎时，可诱导细菌裂解，释放毒素，会增加发展成溶血性尿毒综合症的危险，故应在报告中备注“针对此种病原菌不需要做抗菌药物治疗”。

    如大量铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌、DF-3群细菌、艰难梭菌、产酸克雷伯菌生长，应报告但无需做药敏试验。

责任编辑：陈众，审核：杨乐园、周庭银