固本健脑法对Alzheimer病模型大鼠海马区树突棘及P-tau的影响

阿尔兹海默病（Alzheimer’s Disease，AD）即老年性痴呆，是老年痴呆症的3大类型之一。tau蛋白异常过度磷酸化已是几十年来被公认的AD标志性病理特征。课题组在前期研究证实，学习记忆相关蛋白Caveolin-1在AD发病中起着关键作用，结合树突处tau蛋白过度磷酸化对神经元的双重毒性作用，本课题采用自然衰老大鼠合并双侧海马区注射Aβ_1-42制作复合AD模型，同时给予固本健脑治法方药进行干预，以西药盐酸多奈哌齐（安理申）作为对照；通过高尔基染色法观察用药前后模型大鼠海马区树突棘形态和密度的改变，采用Western Blot法检测模型大鼠海马区Caveolin-1蛋白水平及tau蛋白磷酸化水平，旨在观察固本健脑法对AD大鼠模型树突棘及tau蛋白磷酸化的影响，以探讨固本健脑法治疗AD的作用机理。

1 材料

1.1 实验动物

12 月龄清洁级Wistar大鼠60只，雌雄各半，体质量450±20g，由湖北省疾病防预控制中心实验动物中心提供，动物许可证编号：SCXK（鄂）2008-0005。

1.2 药物

固本健脑液由湖北民族学院附属民大医院制剂室提供。药物组成：板桥党参15g、枸杞15g、茯苓12g、酸枣仁15g、山楂12g。中药常规煎煮法，分别制成每毫升含生药1、2g两个剂量；高、低剂量组分别相当于含生药2、1 g?mL^-1。其中低剂量相当于成人用量。

安理申5mg/片[卫材（中国）药业有限公司，批号：131145A]。取安理申片粉碎后溶于灭菌生理盐水中，配制成浓度为0.045mg?mL^-1的混悬液，磁力搅拌器搅拌均匀。存于4℃冰箱，备用。

Aβ_1-42（美国Sigma公司，批号：107761-42-2）。使用时，将1mg Aβ_1-42溶于200μL生理盐水中，混匀离心后封口膜封好，置于数显恒温水浴锅中，37℃孵育72h，制成聚集态Aβ_1-42，终浓度为5μg?μL^-1。存于4℃冰箱，备用。

1.3 试剂

GMS80020.3神经元高尔基染色试剂盒（上海杰美基因医药科技有限公司，批号：1-250029-12）。Western blot试剂盒：Bradford蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研究所，批号：P0006）、超敏ECL化学发光试剂盒BeyoECLPlus（碧云天生物技术研究所，批号：P0018）；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（武汉谷歌生物科技有限公司，批号：G2003）、蛋白抽提试剂盒（武汉谷歌生物科技有限公司，批号：G2001、G2002）；Tween-20（Amresco公司，批号：0777）。抗体：抗P-tau小鼠单克隆抗体（美国Santa Cruz公司，批号：sc-12414），抗tau兔单克隆抗体（美国Santa Cruz公司，批号：sc-5587）；内参抗β-actin兔单克隆抗体（美国Santa Cruz公司，批号：sc-1616r）。二抗：美国KPL公司。青霉素、水合氯醛、无水乙醇、二甲苯等为自配试剂，由实验室提供。

1.4 实验仪器

TB-718E石蜡包埋机（泰维科技实业有限公司）；RM2245型半自动轮转切片机（德国Leica公司）；Eclipse80i正置荧光显微镜（日本Nikon公司）；光学显微镜（日本Olympus公司）；DYY-6C电泳仪、DYCZ-400D转移电泳仪槽、DYCZ-24DN垂直电泳槽、WD-9405A脱色摇床（北京市六一仪器厂）；2μL微量进样器、搅拌器、电子天平等常规器材由实验室提供。

2 实验方法

2.1 实验分组

将大鼠适应性喂养1周后，随机分为6组，即正常组、空白对照组、模型组、安理申治疗组（简称安理申组）、固本健脑液低剂量组（简称中低组）、固本健脑液高剂量组（简称中高组），每组10只。

2.2 动物造模

大鼠经适应性喂养1周后，除正常组外各组大鼠行脑立体定位手术。大鼠术前禁食12h，手术前称重，按照350mg?kg^-1剂量腹腔注射10%的水合氯醛麻醉，头项部剪毛备皮，脑立体定位仪固定头部，常规消毒手术区皮肤，铺巾，无菌条件下沿颅顶中线做1-2cm切口，用湿棉球分离骨膜，暴露前囟，参照大鼠脑立体定位图谱，定位海马（以前囟为零点，AP=-4.0 mm，ML=±3.0mm，DV=4.0mm），先用牙科钻颅骨钻孔，推进微型进样器注射针，将2μL浓度为5μg?μL^-1的聚集态Aβ_1-42，分别在5min内缓慢注入双侧海马，留针5min，缓慢退针后，以棉签蘸取少许双氧水清洗创面，海绵胶贴封颅骨孔，缝合手术切口并涂马应龙痔疮膏，肌肉注射青霉素10万U防感染。手术结束，大鼠撤离手术台并用神灯照射保暖，待苏醒后放入笼中常规饲养。空白对照组等位点注入等剂量的生理盐水，其余操作同上。正常组不予处理。

2.3 给药方法

手术3天后，中低组、中高组、安理申组大鼠分别按照10mL?kg^-1·d^-1剂量每日5?00p.m.给予相应药物灌胃，空白对照组、模型组给予等容积的生理盐水灌胃，连续4周。正常组常规喂养。

2.4 标本制备及检测指标

2.4.1 大鼠海马区神经元树突棘形态学观察

以10%水合氯醛加倍剂量注射，大鼠深度麻醉后，手术剪剪开胸腔，暴露心脏，从左心室心尖部进针，止血钳固定针头，右心耳处开口约0.5-1cm，快速生理盐水灌注（大约200mL/只），直至肝脏变白，右心耳处流出液体澄清。再用4%多聚甲醛连续灌注（约400mL/只），至大鼠四肢及尾巴、头颈部变僵硬。大鼠断头，冰台上开颅，快速取出大脑，取左侧脑组织海马部位用刀片自横断面切成厚度约5mm的小块，含有10mL Reagent A和10mLReagent B的混合液里（20mL/2块组织块），室温下浸泡孵育2周，避免光照。2周后，取出组织块，用绵纸吸干，按试剂盒说明书进行高尔基染色，于显微镜下观察并照相。

2.4.2 大鼠海马区Caveolin-1、P-tau蛋白表达检测

如上述取脑方法，取大鼠右侧大脑海马组织。Western Blot法检测大鼠海马区Caveolin-1、P-tau蛋白的表达：提取大脑海马总蛋白，Bradford法分标准曲线制作和样品浓度测定完成蛋白浓度测定；制备SDS-PAGE加样液，SDS-PAGE电泳分离蛋白质，行转膜和封闭；分别用Thr231、Ser396、Caveolin-1蛋白的一抗和二抗进行各自抗体的结合反应，运用化学发光分别检测Thr231、Ser396、Caveolin-1蛋白表达量，并运用专用的计算机软件分析量效关系的变化。

2.5 统计学方法

所得数据以均数±标准差（）表示，采用SPSS 15.0进行统计分析，组间数据比较用单因素方差分析，并进行方差齐性检验，方差齐时采用LSD-t检验，方差不齐则采用秩和检验Kruskal-Wallis法，此基础上进行两两比较，采用Nemenyi法，以P<>为差异有显著性。

3 结果

3.1 固本健脑法对AD模型大鼠海马区神经元树突棘形态学的影响

参照相关文献方法，计算各组大鼠海马区神经元树突棘密度。选取高倍镜（400×）下浸染完整的神经元，要求每个树突至少有1个分支；每个标本、每个区域选择至少10个神经元做统计，选取神经元最外围树突作为测量目标，要求树突片断至少10μm长。在光镜下选取合适的片段，再在油镜下拍照。用image-plus6.0分析软件测量树突的长度及树突棘的数目，以树突棘数目除以长度所得值计算树突棘的密度，单位即为树突棘数目/μm。各组大鼠海马区神经元树突棘形态见图1。各组大鼠海马神经元树突棘密度结果，见表1。

图1 各组大鼠海马区神经元树突棘形态

注：图1-1至1-6分别为正常组、空白对照组、模型组、安理申组、中低组、中高组。

注：与正常组比较，^**P<>；与模型组比较，^##P<>；与安理申组比较，^△△P<>。

正常组大鼠海马神经元细胞胞体及胞核清晰，树突棘排列致密（图1-1）。空白对照组大鼠海马区神经元细胞未见明显减少，树突棘形态尚可，数目及密度与正常组比较无明显差异（图1-2）。模型组大鼠海马区神经元胞体变形，部分神经元消失，胞间间隔增大，细胞体积增大，胞质及胞核染色密度增高，树突棘数目减少，排列混乱（图1-3）。安理申组大鼠海马神经元数目较固本健脑法治疗组少，细胞数目有所减少，树突棘密度较模型组稍好（图1-4）。固本健脑法低剂量组海马区神经元未见明显损害，树突棘数目及密度接近空白对照组，明显好于其他治疗组（图1-5）。

由表1 数据可以看出，模型组大鼠海马神经元树突棘密度减少明显，与正常组比较，差异有显著性（P<>）。固本健脑法高、低剂量组大鼠海马神经元树突棘密度比模型组、安理申组均增多，有显著性差异（P<>）。

3.2 固本健脑法对AD模型大鼠海马区Caveolin-1蛋白表达的影响

采用Western blot技术检测Caveolin-1蛋白表达情况，Gel-pro软件测量灰度进行定量分析，实验重复3次，结果用于统计分析。固本健脑法对AD模型大鼠海马区Caveolin-1蛋白表达的影响结果见图2、图3。

图2 各组Caveolin-1蛋白表达灰度图

图3 固本健脑法对AD模型大鼠海马区Caveolin-1蛋白表达的影响

注：与正常组比较，^**P<>；与模型组比较，^#P<>，^##P<>；与安理申组比较，^△△P<>。

Western blot法检测结果显示，与正常组比较，模型组大鼠海马区Caveolin-1表达明显减少（P<>）；经药物干预后，治疗各组药物均能提高大鼠海马区Caveolin-1蛋白表达，与模型组比较，差异有显著性（P<>）；与安理申组对照比较，固本健脑法高、低剂量组有明显优势，差异有显著性（P<>）。

3.3 固本健脑法对AD模型大鼠海马区tau磷酸化的影响

采用Western blot技术检测蛋白，Gel-pro软件测量灰度进行定量分析，实验重复3次，结果用于统计分析。将Thr231、Ser396分别除以总tau作为各个位点相对磷酸化水平，并以正常组的水平标准化为1，用于表示该位点的磷酸化水平。各组大鼠海马区tau磷酸化水平（Thr231，Ser396位点）及固本健脑法的干预作用结果，见图4、图5。

图4 各组Thr231、Ser396位点蛋白表达灰度图

图5 固本健脑法对AD模型大鼠海马区tau蛋白过度磷酸化的影响

注：与正常组比较，^**P<>；与模型组比较，^##P<>。

由灰度图和比值分析可见，Thr231、Ser396两个位点tau蛋白磷酸化水平比较，模型组与正常组和空白对照组比较，差异明显（P<>）；经药物干预后，各治疗组与模型组比较，均有显著改善（P<>）；各治疗组中，固本健脑法中高组、中低组与安理申组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

4 讨论

课题组根据多年对AD的理论及临床研究，认为该病的主要病机为先后天之本（脾肾）亏虚，因虚致实，痰瘀应运而生，蕴于脑窍，致清窍不养或昏蒙；由此认为补益脾肾、固本健脑可作为该病的基本治则治法。依据治则选用湖北恩施传统出口药材——中国板党为主药，辅以枸杞、茯苓、酸枣仁、山楂等健脾补肾、健脑安神、化瘀药物组成固本健脑方，并开发为固定院内制剂（名为固本健脑液）。方中板党健脾培补后天之本，枸杞补肾培固先天之本，是以名之“固本”；枣仁、茯苓补脾肾助本兼养心（脑）安神之功故名“健脑”；山楂消积化瘀以为诸药之佐使。全方以“固本健脑”为治则治法，彰显补肾健脾固本、健脑促智安神之功。自20世纪90年代开始用于临床，至今20余年，得到医患的一致肯定。临床资料表明其对中医辨证之衰老见证积分值有明显改善作用，且未见毒副作用，是为防治AD效果显著的方药。

tau蛋白正常表达是人体所必需，其参与维持细胞正常形态、信息传递、细胞分裂及运动等重要生物学过程。tau蛋白二级结构疏松，在聚合诱导因子和翻译后修饰（主要是磷酸化）作用下形成β折叠结构，此时tau与微管分离失去生理作用，并逐步聚集成tau蛋白二聚体、寡聚体、双股螺旋形神经丝（PairedBelical Filament，PHF）和神经原纤维结（NeurofibrillaryTangles，NFT）。tau蛋白磷酸化与去磷酸化机制的失衡导致tau蛋白过度磷酸化，过度磷酸化的tau蛋白在细胞内相互聚集形成PHFs，这将直接导致微管稳定性下降，轴突运输障碍，神经元变性、凋亡，AD发生。Bi M. 等人研究发现，在没有明显的Aβ沉积时就有tau病理发生，并且降低tau基因敲除小鼠的tau蛋白水平能够阻止Aβ的毒性。另有研究称tau蛋白的关键蛋白激酶GSK-3β能够磷酸化胞内域的淀粉样前体蛋白（Amyloid Precursor Protein，APP），而有效抑制Aβ的生成。换言之，tau过度磷酸化是AD病理改变的源始因素，且从抑制tau磷酸化角度治疗AD亦能有效阻止AD另一重要病理改变Aβ的生成，从而起到更好的作用。

树突棘密度、形态在接受传导信息过程中起重要作用，因此，学习记忆的形态学基础和关键可能就在树突棘。众多新发现tau蛋白在轴突与微管发生重要作用，而在树突处介导Aβ的毒性作用。树突处存在的tau蛋白过度磷酸化一方面会直接引起病理改变使神经元病变，同时还会加剧Aβ对神经元的毒性作用，从而对神经元双重伤害。研究报道，AD患者神经元树突处大量聚集tau蛋白，通过与赖氨酸蛋白激酶（Fyn）发生作用将Fyn转移至树突端，Fyn可促使突触后密度蛋白95（Postsynaptic DensityProtein，PSD95）与NMDA受体作用进而介导Aβ诱导的兴奋毒性作用，抑制过度磷酸化tau蛋白，可以减弱这种毒性作用。另一方面，从形态学上看，树突棘处多发tau蛋白过度磷酸化，会使树突棘丢失或形态发生改变，直接导致神经元突触功能损害，进而出现学习记忆能力的改变，诱发AD。

有研究显示Caveolin-1能够调节tau蛋白、Aβ、NMDA和AMPA的表达，Head B.P.等发现Caveolin-1基因敲除小鼠表现出类似AD海马区的病理改变，即tau蛋白异常过度磷酸化，Aβ表达增加，将敲除Caveolin-1后的神经元细胞体外培养后再转染Caveolin-1质粒，结果显示Aβ表达显著降低。Francesconi A.等国内外研究先后通过实验发现通过调节Caveolin-1能影响NMDA/AMPA受体通道从而增强突触的传递效率、并改善树突棘的形态结构和促进新棘的形成，进而使长时程增强维持和表达增强，改善认知及学习记忆能力。

结合以上研究成果，我们设想，Caveolin-1蛋白水平与tau蛋白过度磷酸化、树突棘形态及密度密切相关。本实验研究结果显示，模型组大鼠海马区Thr231、Ser396两个位点tau蛋白磷酸化水平显著升高；经固本健脑法及安理申等药物干预后，治疗各组大鼠海马区tau蛋白过度磷酸化水平显著下降。加之学习记忆行为学和树突棘形态学的结果和课题组前期研究成果，我们可以得出结论，以培固先后天之本、健脑益智为治则治法组成的固本健脑液是治疗老年性痴呆的有效方剂。固本健脑液能够有效调控AD模型大鼠海马区Caveolin-1蛋白表达水平，并通过调控Caveolin-1水平，抑制tau蛋白过度磷酸化，从而保护树突棘形态及密度，增强学习记忆能力，预防和治疗AD。

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