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推出时间：1977年发明，1986年第一台商业化测序仪Sanger法测序的原理就是，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)使之扩增，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)使之终止。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3‘-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几个至千以上个，相差一个碱基一系列片断。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。主流型号：Genome Sequencer FLX Titanium在测序时，使用“Pico Titer Plate” （PTP）的平板，它含有160多万个由光纤组成的孔，孔中载有化学发光反应所需的各种酶和底物。测序开始时，放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板，每次只进入一个碱基。如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。这个焦磷酸在各种酶的作用下，经过一个合成反应和一个化学发光反应，最终将荧光素氧化成氧化荧光素，同时释放出光信号。此反应释放出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号；由此一一对应，就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。优点：读长长，使得后继的序列拼接工作更加高效、准确。速度快，一个测序反应耗时10个小时，获得4-6亿个碱基对缺点：无法准确测量同聚物的长度，所以检测插入缺失突变的误差率高；通量小且费用高测序引物与接头可以互补杂交，其5‘端可与和邻近序列互补的寡核苷酸相连。八聚体寡核苷酸可竞争性与引物相连接（该寡聚体的第四位和第五位为荧光标记位点）。当其标记颜色被读取后，即将连接上的寡核苷酸在第五位和第六位之间切断，以移除标记，进行下一轮反应，以此依次循环。在第一轮反应中，可以得到确定的碱基位点为：4、5、9、10、14、15位碱基等。重复该反应过程，偏移一位碱基，使用较第一轮少一个碱基的引物进行反应，可以确定的碱基位点包括：3、4、8、9、13、14等，如此往复，直至偏移至引物的第一个碱基（即待测序列0位点碱基）。由于该位点碱基已知，可通过读取的荧光颜色得知位点1的碱基类型，然后，又以位点1碱基荧光颜色推知位点2的碱基类型，依此类推，直至整个序列读序完成。优点：高准确性，每个DNA碱基检测2次，增加了序列读取的准确性这种测序技术通过将基因组DNA的随机片断附着到光学透明的表面，这些DNA片断通过延长和桥梁扩增，形成了具有数以亿计cluster的Flowcell，每个cluster具有约1000拷贝的相同DNA模板，然后用4种末端被封闭的不同荧光标记的碱基进行边合成边测序。这种新方法确保了高精确度和真实的一个碱基接一个碱基的测序，排除了序列方面的特殊错误，能够测序同聚物和重复序列。缺点：在成本上目前高于第三代测序，样本制备过程复杂，样本要求相对较高主流型号：HeliScope? Single Molecule SequencerDNA被随机打断成小片段，在每个小片段（~200 bp）的末端加上poly-dA，并于玻璃芯片上随机固定多个poly-dT引物，其末端皆带有荧光标记，以利于精确定位。首先，将小片段DNA模板与检测芯片上的poly-dT引物进行杂交并精确定位，然后逐一加入荧光标记的末端终止子。这个终止子与Illumina的终止子可不一样，不是四色的，是单色的，也就是说所有终止子都标有同一种染料。在掺入了单个荧光标记的核苷酸后，洗涤，单色成像，之后切开荧光染料和抑制基团，洗涤，加帽，允许下一个核苷酸的掺入。通过掺入、检测和切除的反复循环，即可实时读取大量序列。最后以软件系统辅助，可分析出完整的核酸序列。优点：真正的单分子测序，无需前期扩增，不引入偏向性;特别适合RNA-Seq或RNA直接测序的应用，因为它能直接测序RNA模板，而无需将其转化成cDNA。检测碱基替换突变的误差率非常低，~0.2%。缺点：错误率高，Insertion 1.5%，Deletion 3.0%；Heliscope在面对同聚物时也会遇到一些困难，但可以通过二次测序提高准确度；由于在合成中可能掺有未标记的碱基，因此其最主要的错误来源是缺失。推出时间：2009年底Science论文发表，2010年推出采用了高密度DNA（玻璃板）纳米芯片技术和非连续、非连锁联合探针锚定连接（cPAL）技术来进行测序。基因组随机打断成500bp随机长度的片段，两端接上接头，成环，限制性内切酶酶切，重复2次，最终连接成一个DNA环，现阶段4接头建库方法能够支持70bp单端测序（35bp双端测序）。接着每个DNA环在反应液中高速扩增，形成一个纳米球（DNB），这样每一个DNA环大约扩增了200次。然后把这些纳米球平铺到预先处理过的玻璃板上，形成纳米芯片。最后通过非连锁联合探针锚定连接（cPAL）技术进行测序，10bp长的探针上有一个锚定碱基（A or T or G or C），其他位置都是N，通过与模板的杂交连接反应，根据4种不同的碱基（A/T/G/C）会有四种不同的荧光信号，总共需要40种不同的锚定探针。每一种锚定探针杂交之后都会进行洗脱。通过DNB芯片的荧光显影结果及解码分析，可以确定每个DNB的核酸序列。这项技术的核心在于使用了Zero-Mode Waveguide（零波段边界）。测序的平台上有几万个小井，单个DNA聚合酶和要测序的DNA链固定在每一个小井里。带有荧光标记的脱氧核苷酸(A,T,C,G)被加入到每个小井里。每一种脱氧核苷酸在激化后分别能放出不同波长的荧光。小井的底部开了一个非常小的孔，小到比探测激光的单个波长还要短。根据我们的常识，这个孔太小了，激光无法从井的底部穿过去，从而无法激发脱氧核苷酸上的荧光物质。应此，底部的显微镜检测到的是一片黑暗。但是我们知道光线是一种波，它会衍射，激光虽然不能完全穿过小孔照亮整个小井，但它能透过小孔而勉强照亮小孔附近很小的一个区域。而DNA聚合酶正好被固定在这个小区域。当有单个脱氧核苷酸加载在DNA聚合酶上形成新的化学键时，这个脱氧核苷酸上的荧光物质被激活而发光，从而被显微镜观测到。这种特定颜色的荧光只持续一小段时间，应为这个碱基在DNA链上合成之后，它的荧光基团就会被剪切掉，从而继续下一个碱基的合成。当DNA链合成结束之时也是DNA链测序完成之时。但DNA聚合酶的活性会在激光照射下逐渐减弱，不能无限长度的进行合成反应，因此DNA链的测序长度也是有限的。优点：读长长；无需PCR扩增，也避免了由此带来的bias；需要的样品量很少；样品制备时间花费少；用RS系统可以远程快速获取数据和选择测序参数；通量灵活；时间快主流型号：Ion Personal Genome Machine?该测序仪使用了一种高密度半导体小孔芯片。该芯片置于一个离子敏感层和离子感受器之上，每当有核苷酸分子被掺入时就会释放出质子，而离子感受器就会感受到这种信号，知道是哪一个核苷酸被掺入，从而读出DNA序列。优点：无以伦比的快速，2个小时完成测序工作；Ion Torrent的化学测序原理自然简单，无修饰的核苷酸、无激光器或光学检测设备，因而可达到极小的测序偏差和出色的测序覆盖均衡度缺点：测序通量目前还不够大，增加半导体芯片的容量将有望提高测序仪的处理能力。主流型号：MiSeq Personal Sequencing System测序原理：边合成边测序这种测序技术通过将基因组DNA的随机片断附着到光学透明的表面，这些DNA片断通过延长和桥梁扩增，形成了具有数以亿计cluster的Flowcell，每个cluster具有约1000拷贝的相同DNA模板，然后用4种末端被封闭的不同荧光标记的碱基进行边合成边测序。这种新方法确保了高精确度和真实的一个碱基接一个碱基的测序，排除了序列方面的特殊错误，能够测序同聚物和重复序列。优点：样品制备简单快速，在一台仪器上完成测序和数据处理；可靠的化学方法，可逆中止碱基边测序边合成法
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