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illumina SBS测序详解

2019-06-22  生物_医药...

最近回头重新看了illlumina paired end sequence的测序原理视频,发现了以前没有注意的一些问题,而这些问题也是大家平时容易搞错的,因此花了几天时间将illumina 的paired end sequence 从构建文库到上机测序的整个过程以及原理较为详细的写了出来。

基础知识:illumina测序的核心在于利用可逆终止的、荧光标记的dNTP进行边合成边测序

                  Flowcell(流动池)是有着2个或8个lane(泳道)的玻璃板,。每个lane可以测一个样本或者多样本的混合物,且随机布满了能够与文库两端接头分别互补配对或一  致的寡核苷酸(oligos,P7和P5接头)。一个lane包含两列,每一列有60个tile,每个tile会种下不同的cluster,每个tile在一次循环中会拍照4次(每个碱基一次)。

paried-end sequencing

一、Library Preparation文库的构建

  1. 利用转座子(transposome)对双链DNA进行剪切以及接头(adapter)的连接



  2. 接头连接成功后,利用低循环扩增技术在接头处进行修饰,分别在两端添加sequencing primer binding site1/sequencing primer binding site2(即测序引物结合位点)、index1/index2以及我们称之P5和P7的寡核苷酸序列


上图并没有将之前的adapter标志出来,下图是维基百科的示意图,详细一些。


这里要注意两点(1)P5和P7是不同的,它们分别和flowcell上的接头互补和相同。为了方便阐述,将与P5互补的接头称为P5’与P7互补的接头称为P7’。(2)index1和index2也是不同的,与P5相连的是index2,与P7相连的是index1。

     关于index,也叫barcodes,因为一个lane可以同时测多个样品,为了避免混淆样品的read products,每种样品的DNA由一种index修饰,这样测序得到的reads都是具有index标记的,在测序结果中,依据之前标签与样品的对应关系,就可以获得对应样品的数据。而这里的index1和index2是为了区分paired-end测序得到的双端reads

二、Cluster generation 簇生成

  1. Flowcell上随机分布了两种不同的寡核苷酸序列,分别与P5互补(即P5’),与P7一致(即P7)


  2. 待测sequence通过P5与folwcell上的P5’序列杂交互补,以待测sequence为模板进行互补链(即reverse strand)的延伸,互补链的两端为P5’和P7’。


  3.  接下来模板链被切断并洗下


   Reverse strand的P7’与Flowcell上的P7杂交互补,进行链的合成,这就是我们所熟知的桥式PCR

           

  接下来合成的双链被解链,再分别与Flowcell上的接头杂交互补,延伸....解链,杂交,延伸,解链...如此重复35个循环

 

  4. 桥式PCR完成后,使用NAOH将双链解链,并利用甲酰胺基嘧啶糖苷酶(Fpg)对8-氧鸟嘌呤糖苷(8-oxo-G)的选择性切断作用,选择性地将P5’与链的连接切断,留下与Flowcell上P7连接的链,也就是Forward strand。同时游离的3’端被阻断,防止不必要的DNA延伸

三、测序

  1. 测序引物(sequencing primer)结合到靠近P5的测序引物结合位点1(sequencing primer binding site 1)上,在系统中加入四种dNTP和DNA聚合酶。这里的dNTP有两个特点:它是有荧光基团标记的,每种碱基标记的荧光基团不一样。它的3’末端连了一个叠氮基。这个叠氮基能够阻断后面的碱基与它相连


  因此在聚合酶的作用下,与Forward strand相应位置碱基配对的dNTP就会结合到新合成的链上,而由于叠氮基的存在,后面的dNTP无法继续连接。这时用水将剩余的dNTP和酶给冲掉,将Flowcell进行扫描,扫描出来的荧光对应的碱基的配对碱基即是该链该位置的碱基。同时在这个Flowcell上有成千上万个cluster也在进行同样的反应,因此一个循环就能同时检测多个样本(这也是高通量的核心所在)。这个循环完成后,加入化学试剂把叠氮基和标记的荧光基团切掉,进行下一个循环(碱基的连接、检测与切除)。如此重复直至所有链的碱基序列被检测出。也就是Forward read 序列。

  2. Index测序:所有循环结束后,read products 被洗掉,index1 primer与链上index primer1 结合位点杂交配对,进行index1的合成及检测


  3. Index1测序完成后,洗脱测序产物。此时机器已通过荧光得到了index1的序列


  4.Index2测序:Forward strand顶端的P5序列与Flowcell上的P5’杂交配对,进行index2测序。测序完成后洗脱产物

      

四、Paried-end sequencing(即对Reverse strand测序)

  1. 洗脱index2测序产物后,以Flowcell上的P5’为引物,Forward strand为模板进行桥式扩增,得到双链


  2. NAOH使双链变性为单链,并洗去已经测序完成的Forward strand

 

  3.   类似的,readprimer2结合到靠近P7’的read primer binding site 2开始对Reverse strand的测序。测序完成后即可得到Reverse read序列。


总结:有两点需要重点注意:(1)DNA片段连接的两个接头P5和P7,它们与Flowcell上的两种寡核苷酸序列分别互补和相同,并不是都相同

                                               (2)结合在DNA片段两端的index序列也不同,分别是index1和index2

前面介绍的都是paired-end的测序,而single-end测序方式是只将index,sequencing primer binding site以及P7/P5添加到 fragamented DNA片段的一端,另一端直接连上P5/P7,将片段固定在Flowcell上桥式PCR生成DNA簇,然后单端测序读取序列

最后给出illumina的官方视频

http://v.youku.com/v_show/id_XMTI1MjA5Mzg5Mg==.html?spm=a2h0k.8191407.0.0&from=s1.8-1-1.2

                                                                                                                          


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