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大家可能都熟知illumina文库构建使用的Y型接头中的P5/P7（如图1中绿色和蓝色部分），当dsDNA变性为ssDNA后，ssDNA被加载到Flowcell上，P5/P5'和P7/P7'与Flowcell表面的2种Oligo（草坪接头）互补结合，结合后的ssDNA快速进行Bridge PCR生成Cluster，但如图3/4所示，经过PCR后的dsDNA分子两末端分别为P5、P7和与之为互补关系的P5'、P7'，那么到底是P5/P5'/P7/P7'的哪2种与Flowcell表面的Oligo互补呢？或者换个说法：Flowcell表面的Oligo是P5/P5'/P7/P7'中的哪2种呢？ 图1为标准的illumina TruSeq 单index（i7）文库结构，P5至P7的方向为5'端到3'端。 图2/3为文库构建中的PCR环节，dsDNA的正负链经过PCR会产生2种类文库，我们可分别将其称为正链文库和负链文库，后续图4～7只讲解正链文库测序，负链文库同理。 图4为正链文库PCR后的形态（图中A链与正链序列相同，B链与正链互补），这里我们以单index的PE测序（读取顺序为Read1、index、Read2）为例进行说明。对于正链文库的测序，我们希望尽可能得到的测序序列直接就是正链序列信息（即A链），例如图4中的Read1和index，只要以B链为模板进行聚合测序，那么测序所得序列即为正链序列（A链）。 既然需要以B链为模板进行测序，那么就需要在Flowcell上先生长出B链来（生长方向5‘端到3’端）。 图5中1至2，即B链在Flowcell上“生长”的过程，因此Flowcell上2种oligo中有一种与P7互补（P7'）,它可以捕获以P7为末端的ssDNA（A链）的并生产大量的B链，以便后续以B链为模板完成Read1和index的读取工作。另外我们可以看到B链的3'末端是P5'，这也就意味着如果想进行Bridge PCR，Flowcell表面的另外一种Oligo就需要跟P5'互补（P5），所以如图5中3所示，B链弯曲后与Flowcell表面的另外一种Oligo 互补结合，生长出与A链序列相同但方向相反的模板。 图6/7为测序过程展示，从图中可以看出，以B链（与正链序列互补）为模板完成Read1和index的序列读取，测序结果即直接为正链序列信息。而以正链（A链）为模板完成的Read2为正链序列的反向互补序列，因此我们在做生信分析时，需要将Read2序列做反向互补处理。 总结，Flowcell表面的2种草坪接头，一种与P5相同，捕获以P5'为末端的ssDNA模板，一种与P7'相同，捕获以P7为末端的ssDNA模板。 |
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