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一、引言
常规PCR技术的一个基本条件是在待扩增片段的两翼各有一段已知序列。在实际工作中常常仅知道基因上一小段序列信息,在这种条件下就难以通过常规PCR技术扩增得到邻近的片段。
随着PCR技术的发展,出现了一些根据一小段序列信息快速扩增已知序列相邻片段的技术,其中之一就是锚定PCR(
anchored PCR)或锚式PCR( anchor PCr)技术,在有些文献中也称之为单侧特异引物PCR( single-specific
sequence primer PCr,
SSP-PCR)。在锚定PCR中,一条引物为根据已知序列设计的序列特异性引物,另一条则是根据序列的共同特征设计的非特异性引物。这种非特异性的通用引物起到在其中一端附着的作用,故称为错定引物,与锚定引物结合的序列则称为锚定序列。
种常用的锚定PCR技术是以DNA文库中载体上的一小段序列作为锚定序列。还可把通过人工合成的特定序列连接到DNA片段上作为锚定序列,这种技术称为连接锚定PCR(
ligationanchored
PCR)。同聚物也是锚定PCR中常用的锚定引物,由于在成熟mRNA3端大多有一段poly(A)尾巴,可以利用这一序列特征设计一段
oligo(dT)作为锚定引物,以cDNA为模板通过锚定PCR扩增特定基因。这种以cDNA为模板的锚定PCR技术称为互补锚定PCR(
complementary anchored PCr)。
二、原理
通过锚定PCR从基因文库中扩增已知序列相邻基因的方法是
Huang等提出来的,其原理如图2-4所示。在该方案中两条特异引物是根据基因上部分已知序列设计的正反向序列特异性引物,分别用于扩增其3和5′端的未知序列。另外两条引物是根据载体的序列设计的,这两条引物的靶序列是文库中共有的,对文库中插入的外源DNA序列不具选择性,因此称为非特异性引物。在锚定PCR中就是分别利用一条序列特异性引物和载体上的非特异性引物进行PCR扩增。
锚定PCR操作一般包括三轮PCR扩增,第一轮釆用不对称PCR的方法。不对称PCR是在PCR扩增时使用的两种引物浓度不同,一般高浓度引物与低浓度引物的浓度比为50~100:1,一般不对称PCR的目的是生成供测序用的单链DNA模板。在不对称PCR中最初10~15个循环的产物主要是双链DNA,待低浓度引物耗尽后,继续由高浓度引物介导产生大量单链DNA。在本实验中采用了高浓度特异性引物与低浓度非特异性引物(两者浓度比为20:1),从而增加第一轮PCR扩增的特异性。将第一轮PCR产物稀释作第二轮POR的模板,引物为相同浓度的特异性引物和非特异性引物,通过这一轮PCR扩增即可得到双链DNA。第三轮PCR目的主要是检测所得PCR产物是否为预期产物。
借助大多数天然mRNA所带有的
poly (A)尾,可以采用人工合成的olgo(dT)作为锚定引物,以cDNA为模板扩增特定基因。在有些文献中称这种方法为互补锚定PCR(
complementaryanchored
PCR),其原理如图25所示。已知特定序列下游端(3′)和上游端(5)序列的扩增方法有所不同,相对来说前者操作较简便一些。已知特定序列下游端(3)的扩增,首先是合成DNA,再分别以一段特异性引物和一段非特异性引物[在本实验中采用
oligo(dT)2]扩增得到特定序列。扩增已知特定序列上游端(5′)序列时,首先需要根据已知序列设计序列特异性引物,并以此引导合成特异性的cDNA,再通过末端转移酶在靶序列上添加一段人工合成的poly(A)尾以提供第二条引物的退火位点。
三、问题及对策
(1)非特异性扩增是PCR实验中常见的问题,在使用单侧引物时这个问题更为严重从理论上讲对于任何基因,只要有足够长度(20~40个核苷酸)的已知序列,都可以成功地扩增其上游或下游序列。但实际上,单条序列特异性引物并不是总是具有足够选择性。这条引物可能结合在不适合的序列上或者部分互补的序列上,扩增出不只段序列来。如果这段唯一的特异性引物是从蛋白质部分测序结果反推得到或者是由同源的保守区确定的,这个问题就更为复杂。在这些情况下需要采用简并的(非均质的)序列特异性引物,使锚定PCR扩增的特异性进一步降低使用简并引物的后果取决于扩增模板、简并程度和扩增条件。应尽量采用非简并的序列特异性引物,在简并引物非用不可时,常规PCR扩增方法中简并引物的设计原则在锚定PCR中同样适用。在一些多义位置使用脱氧次黄嘌呤降低引物的复杂性,也是减少非特异性扩增的一种有效办法。
(2)在锚定PCR的起始阶段很少会获得完全特异性的扩增异质性的扩增产物在琼脂糖凝胶上呈现涂抹状条带,通过本方案获得的PCR产物应该用特异性的内侧寡聚物为探针通过Southern印迹进行检测。在本方案的开始阶段作这种检测尤其重要,从而确定扩增产物中有目标产物。
3)增强锚定PCR中对靶标特异性的措施用第二条序列特异性引物(嵌套引物)重新进行一轮PCR可在很大程度上减少非特异扩增产物。嵌套引物可以直接与第一条引物相连,这样有40~50个核苷酸的已知序列就足以进行这种两轮扩增的锚定PCR。也可在琼脂糖凝胶上涂抹状条带中分离出主条带,或者分离通过
Southern杂交预先探知的目标条带,用这些按片段大小分离的产物作为第二轮PCR扩增的模板,以增加产物的特异性。若用低熔点琼脂糖凝胶分离第一轮扩增产物,可简单地切下所需条带,再把这些小凝胶块放在PCR混合物中,不需进一步纯化便可直接进行下一轮的重新扩增。
(4)在互补错定PCR中,mRNA的质量和完整性以及合成cDNA模板的质量在很大程度上决定着实验的成败在制备mRNA或cDNA时应当釆取谨慎措施确保产物完整且产率高。此外,在这些实验方案中有许多步骤涉及单链核酸(mRNA及cDNA第一链)的操作,最好使用硅化过的微型离心管和吸头。在互补错锭PCR中另一个影响因素是poly(A)尾的长度,无论这条尾巴是天然的还是酶法添加上去的。poly(A)尾较长则为非特异性引物
oligo(dT)2的结合提供了大量可能的配对位点,因而所得PCR产物可能长短不一。如前所述,有多个解决这一问题的办法,包括合成一段杂合的寡核苷酸,其3端为多聚T,5端为具有特异性的非同聚序列。另外也可以在特异cDNA产物的3′端连接一段特异寡核苷酸,这样就可以利用这些非均质的多聚物进行随后的PCR扩增。还可设计3′端为简并碱基(A、G或C)的寡核苷酸,以助寡核苷酸在poly(A)的边界处退火,也达到提高特异扩增的目的。
(5)经验证明6,在互补锚定PCR中,用于同聚物加尾的寡聚核苷酸过量会影响下一轮扩增,最好予以去除,但去除寡核苷酸引物时会导致cDNA损失,因此在cDNA合成时应控制好寡核苷酸引物的用量,并在反转录后通过乙醇沉淀收集合成的cDNA。
(6)在从文库中扩增特定基因时,文库的质量是至关重要的。最好用已知序列对文库的质量进行检查,如果文库质量不好,应重新构建。由于在文库中不同重组克隆的生长速度差异很大,往往造成文库在扩增过程中的失真,因此在进行PCR扩增时最好使用原始文库
(⑦)某些DNA靶标不能用标准的PCR条件有效地进行扩增在这种情况下,可将低收率的PCR产物克隆至适当载体,然后通过菌落杂交分离适当克隆。倘若Taq聚合酶错误倾向较高,从PCR克隆获得的片段应通过多个克隆的分离和测序互相印证而加以确定。
四、小结
利用仅知的小段序列信息获得全长基因是基因分离和鉴定中常常遇到的问题,解决这种问题的常规方法首先制备基因文库或cDNA文库,根据已知序列合成特异探针对文库进行筛选,从文库中分离目的克隆,有时还要进行几次亚克隆,再进行测序。这种方案虽然可行,但步骤烦琐、周期较长,而且实验成功与否很大程度上取决于所构建文库的质量。一些早熟CDNA分子终止过早,不能反映全长mRNA信息,往往因此而影响cDNA文库的质量。此外,在制备文库过程中稀有mRNA也常常会全部丢失。而本章为解决这种问题提供了一个简便的实验方案,采用锚定PCR技术获得未知的全长基因一般1~3天可以完成。在锚定PCR方案中,只有1条引物是根据目标序列上的已知序列信息设计的序列特异性引物,另一条引物是根据序列的共同特征设计的非特异性引物,包括载体序列、连接上去的特定序列和寡核苷酸序列。目标序列的PCR扩增过程与常规PCR技术是相同的,非特异扩增问题在锚定PCR技术中尤显严重,常常采用不对称PCR、使用嵌套引物等手段,加强对目标序列扩增的特异性。
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