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RNA扩增技术的出现和发展，解决了RNA相关实验样本不足的问题，而且从1990年，Brady首次描述了一种基于链式聚合酶反应（PCR）的cDNA扩增方法之后，几乎同时Eberwine等提出了基于体外转录的线性RNA扩增方案，自此，各种RNA扩增方法被发展出来。面对这么多RNA的扩增方法，如何才能找到一款适合自己实验设计的RNA扩增方案呢？
其实，迄今为止，RNA扩增的方法虽然很多但不外乎三个策略：(1) PCR指数扩增；(2) 体外转录线性扩增；(3) Phi29 聚合酶扩增。通过扩增，RNA被放大了几百万倍，从皮克级别增加到微克级别，继而可以进行后续的测序文库构建以及测序，且后续操作与普通样品操作相同。 1. 基于PCR的cDNA扩增 对极少量（单细胞也可）RNA进行反转录，所用引物为poly(T)并加上锚定序列UP1，没有被利用的引物要消化掉。Poly(A)尾加到cDNA第一链的3’末端，cDNA第二链用加锚定引物序列（UP2）的poly（T）合成。用UP1和UP2为引物对cDNA进行均匀的PCR扩增，扩增产物片段化后，在末端加上P1和P2引物。最后，微滴PCR通过将文库与共价结合在1mm珠子表面的P1引物混合进行。 优点：通过延长反转录时间，获得过半的表达基因的全长cDNA；通过延长PCR扩增的延伸时间，使cDNA长度更长；基因片段化选择80-130bp，尽量保留了短cDNA；采用热启动Taq酶，减少背景扩增；采用5’-端带胺基的引物防止cDNA双链的5’端与SOLid文库接头连接。 缺点：无poly（A）的RNA不能被检测，长度大约3kb的RNA的5’端不能被检测，由于cDNA是双链，不能区分sense链还是antisense链。
、 2. SMATRER扩增方法 Smarter的方法最早用于cDNA文库的构建，至今clontech的文库构建仍然采用此种方案。将smarter方法用于RNA扩增的方法：CDS 引物含有SfiIB位点，启动反转录。一个模板转换寡核苷酸序列（TS-Oligonucleotides），含有SfiIA位点。 当反转录到达RNA5’末端后，逆转录酶的末端转换活性会在cDNA末端加非模板编码的核苷酸，通常是dCTP，TSO包含3个组成的rG，在3’端作为反转录合成的第二个模板。当反转录到达mRNA的5’末端，TSO3’的r（G）3和cDNA序列中富含dC的序列依靠互补作用促进模板转换。反转录酶会转录这个寡核苷酸序列，从而使cDNA带了SfiIA的锚定序列。双链cDNA的产生是通过PCR完成，引物为5’锚定序列和CDS引物序列。 优点：能够得到全长cDNA。用于分析可变剪切等 缺点：只分析带Poly（A）的RNA
3. 两轮体外转录扩增法 第一链cDNA合成时所使用的引物为T7-Oligo（dT）,以便引入一个T7启动子，后续用SuperIII反转录酶催化反应生成cDNA一链，第二链cDNA合成过程中，cDNA:RNA杂交产物中的RNA被RNase H消化成小片段，引导cDNA第二链的合成。利用带T7转录启动子的双链DNA，启动体外转录合成大量aRNA(T7 RNA聚合酶)。使用第一轮合成的RNA进行第二轮的第一链cDNA合成，引物是随机引物，Super II反转录酶催化生成cDNA。第二轮中的第二链cDNA合成先用RNase H把DNA:RNA杂交产物中的RNA消化，第二链cDNA合成用T7-Oligo(dT)引物合成cDNA。再次使用体外转录法第二轮合成大量aRNA。 优点：利用总RNA样品，可成百万倍线性扩增mRNA，去除了模板依赖性。 缺点：只能分析带polyA的mRNA。扩增后的片段在300-3000bp范围内，平均长度在500bp左右，大部分不是全长cDNA，具有3′端偏好，对于分析RNA的可变剪切并不是一个好的选择。
4. Ovation扩增方法 Ovation采用了SPIA技术，该技术在cDNA一链合成时，采用了一种独特的一链合成引物，该引物为DNA/RNA的嵌合引物混合物，它的DNA部分能够和poly（A）的5′末端部分或整个转录本的任意部分进行杂交，反转录时每条引物的3′DNA末端都能够独立反转录出一链cDNA。生成的cDNA/mRNA杂交分子在cDNA链的5′末端包含一个特殊的RNA序列。 将cDNA/mRNA复合体的mRNA分子进行片段化，生成合成引发位点使DNA聚合酶能够催化cDNA二链的合成，且二链包含与5′特异序列互补的一链中的嵌合引物。SPIA采用等温链置换扩增反应，使用DNA/RNA嵌合的SPIA引物、DNA聚合酶和RNase H进行RNA扩增反应。 优点：可以分析除rRNA之外所有RNA，可以进行微量样本的lncRNA的分析，并且可以分析RNA降解的样本。 缺点：RNA起始量越高，在测序数据中的rRNA reads会相应增加。
当然还有其它很多方法，例如MALBAC法，Phi29多重链置换法等不再一一列举。 |
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