RT-qPCR 基本原理

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起始材料：RNA

定量逆转录PCR（quantitative reverse transcription PCR, RT-qPCR）是应用于以RNA作为起始材料的PCR实验中的一种实验方法。在该方法中，总RNA或信使RNA（mRNA）首先通过逆转录酶转录成互补DNA（cDNA）。随后，以cDNA为模板进行qPCR反应。RT-qPCR已被用于多种分子生物学的应用中，其中包括基因表达分析、RNA干扰验证、微阵列验证、病原体检测、基因测试和疾病研究。

RT-qPCR的一步法与两步法

RT-qPCR可通过一步法或两步法来完成（图1、表1）。一步法RT-qPCR把逆转录与PCR扩增结合在一起，使逆转录酶与DNA聚合酶在同一管内同样缓冲液条件下完成反应。一步法RT-qPCR只需要利用序列特异性引物。在两步法RT-qPCR中，逆转录和PCR扩增过程是在两个管中完成，使用不同的优化的缓冲液、反应条件、以及引物设计策略。

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图 1.一步法与两步法RT-qPCR

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	优点	缺点
一步法	由于两步反应都在一个管中完成，因此该方法具有更少的实验误差 更少的移液步骤能够减少污染的风险 适用于高通量扩增/筛选，快速且可重现性高	无法分别对两步反应进行优化 由于反应条件是结合两步反应折衷得到的，因此灵敏性不如两步法 单一样品检测的靶点数较少
两步法	能够建立可以长期保存，并用于多次反应的稳定的cDNA库 靶基因和内参基因能够从同一个cDNA库进行扩增，而不需要多重cDNA库 能够优化单一反应过程的反应缓冲液和反应条件 灵活的引发条件选择	使用多个试管，以及更多的移液步骤会增加DNA污染的风险, 并且耗时。 相较于一步法，需要进行更多的优化

表 1.一步法及两步法RT-qPCR优缺点比较

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RT-qPCR逆转录过程

总RNA与mRNA的选择

在设计RT-qPCR实验过程中，决定是否要使用总RNA或纯化的mRNA作为模板进行逆转录十分重要。尽管mRNA可能能够提供略高的灵敏度，但总RNA仍经常使用。其原因是总RNA作为起始材料具有较mRNA更重要的优势。首先，其过程需要较少的纯化步骤，这确保了更好的定量回收模板和更好的把结果标准化为起始的细胞数。其次，其避免了mRNA富集步骤，这能够避免由于不同mRNA的回收率不同而带来的结果偏移的可能性。总的来说，由于在大多数的应用中，目标基因的相对定量比检测的绝对灵敏度更为重要，因此在大多数情况下，总RNA更适用¹。

逆转录引物

在两步法中，有三种不同的方法可用于引发cDNA反应：oligo(dT) 引物、随机引物、或序列特异性引物（图2，表2）。通常情况下，是将 oligo(dT) 引物和随机引物进行混合使用。这些引物退火至模板 mRNA 链，并提供给逆转录酶一个用于合成的起点位置。

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图 2.两步法 RT-qPCR 中四种逆转录引发方法。

引物选择	结构与功能	优点	缺点
Oligo(dT) 引物（或锚定 oligo(dT) 引物）	延展退火至 mRNA poly(A) 尾部的胸腺嘧啶残基；锚定 oligo(dT) 引物的3’端包含一个G、C或A （锚定位点）	利用连接有 poly(A) 尾的 mRNA 合成全长的 cDNA 适用于可利用起始原料较少的情况 锚定位点能够确保 oligo(dT) 引物结合至 mRNA 5’ 端 poly(A) 尾部	只适用于扩增带有 poly(A) 尾的基因 得到从 poly(A) 内引发位点*2处截断的 cDNA 偏向与3’端结合* *若使用锚定 oligo(dT) 引物将最小化这一可能
随机引物	长度为6至9个碱基，在 RNA 转录过程中，其可退火至多个位点	可退火至所有 RNA（tRNA、rRNA、以及 mRNA） 适用于转录产物具有显著二级结构，或者可利用起始原料较少的情况 高 cDNA 产量	cDNA 是由所有的 RNA 逆转录得到，通常不是想要的，并可能稀释目标 mRNA 的信号 得到截断的 cDNA
序列特异性引物	靶向特异的 mRNA 序列的定制引物	特异的 cDNA 库 提高灵敏度 使用反向 qPCR 引物	只限定在单个目的基因的合成

表 2.RT-qPCR 的 cDNA 合成中的引物注意事项。结合使用随机引物与锚定 oligo(dT) 引物可提高逆转录效率及 qPCR 的灵敏度。

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逆转录酶

逆转录酶是利用 RNA 合成 DNA 的一种酶。一部分逆转录酶具有 RNA 酶活性，能够在转录后降解 RNA-DNA 杂交链中的 RNA 链。如果其不具有 Rnase 酶活性，可加入 RNaseH 以获得更高的 qPCR 效率。常用的酶包括莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶和禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶。对于 RT-qPCR 来说，理想的情况下是选择具有较高热稳定性的逆转录酶，这样 cDNA 的合成能够在较高的温度下进行，确保成功转录具有较高二级结构的 RNA，同时保持其在整个反应过程中的全部活性，从而得到更高的 cDNA 产量。

逆转录酶的 RNase H 活性

RNase H 能够从 RNA-DNA 双链中降解 RNA 链，从而允许双链 DNA 的有效合成。然而，当使用长 mRNA 作为模板，RNA 可能被过早的降解，从而导致截短的 cDNA。因此，在 cDNA 克隆过程中，如果需要合成长的转录物时，尽量减小 RNase H 的活性通常是有益的。与此相反，拥有 RNase H 活性的逆转录酶通常有利于 qPCR 的应用，因为它们能够在 PCR 的第一个循环中提高 RNA-DNA 双链的熔解（图3）。

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图 3.逆转录酶中 RNase H 活性。在 qPCR 中，使用具有 RNA 酶活性的逆转录酶。

• Step 1 预变性（可选）

• Step 2 引物延伸

• Step 3 cDNA 合成

• Step 4 反应终止

如果 RNA 模板具有较高的二级结构建议操作该步骤。

该步骤建议用于引物的延伸。

逆转录酶以 mRNA 为模板合成 cDNA 链。

该步骤可阻止活性逆转录酶带来的 qPCR 抑制。

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RT-qPCR 的 qPCR 过程

引物设计

用于 RT-qPCR 中 qPCR 步骤的 PCR 引物最好应设计成跨越一个外显子-外显子连接，其中一条扩增引物可以潜在地跨越实际外显子-内含子边界（图4）。由于含内含子的基因组 DNA 序列不会被扩增，因此这种设计可以减少从污染的基因组DNA中扩增得到的假阳性的风险。

如果引物不能被设计成能够分离外显子或外显子-外显子边界，则有必要利用无 RNA 酶的 DNA 酶I或 dsDNA 酶处理 RNA 样品以除去基因组 DNA 污染。

RT-qPCR 对照

一个逆转录阴性对照（-RT对照）应该包括在所有的 RT-qPCR 的实验中，以检测 DNA 污染（如基因组 DNA 或来自之前反应的 PCR 产物）。这一对照包含除逆转录酶之外的所有反应组分。由于该对照不会发生逆转录，因此如果观察到 PCR 扩增，则极有可能来自 DNA 的污染。

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图 4.RT-qPCR 中 qPCR 步骤的引物设计。1）如果一个引物被设计为跨越外显子-内含子边界，则可能造成污染的基因组 DNA 将不会被扩增，其原因是引物不能退火至该基因组 DNA 模板。相反，cDNA 不含任何内含子，能够有效被引物识别并扩增。2）当引物侧接一个长的内含子（例如1 kb），扩增反应将不会发生，因为短的延伸时间仅够用于扩增短的 cDNA，却不足以扩增基因组靶基因。

参考文献

1. Bustin S. (ed) (2004) A-Z of Quantitative PCR.IUL Biotechnology Series, International University Line, La Jolla, California.