【从RNA提取到qPCR原创系列二】反转录相关概念及实验策略

1970年Baltimore, D. 和Temin, H. M.等学者发现了反转录酶，证明遗传信息不仅由DNA到RNA，也可由RNA到DNA ，这一发现对分子生物学的中心法则进行了修正和补充。 

反转录就是反转录酶以RNA为模板，根据碱基互补配对原则，合成cDNA的过程。

今天为大家分享有关反转录的一些理论知识，主要包括反转录酶的概述和反转录的实验策略这两大方面。

01

反转录酶的概述

1反转录酶的酶学特性

• 具有依赖于DNA或 RNA模板的DNA聚合酶活性， 反转录酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。

• 具有降解DNA:RNA杂合双链中RNA的RNase H活性；

• DNA聚合酶活性和RNase H活性均为病毒复制循环所必需。这两个活性中心在结构上是相互独立、单独折叠的两个结构域，在反转录酶上的相对位置固定。其中，DNA 聚合酶结构域位于N端，RNase H结构域位于C端；

2反转录酶的结构研究

Kohlstaedt L A等研究者于1992年在Science上发表一篇报道，提出了HIV-1 RTase的右手结构模型，其中“手指”是与合成中引入的脱氧核苷酸相互作用，“拇指”是与模板相互作用，“手掌”是催化磷酸转移。

3DNA聚合酶活性

• DNA聚合酶活性的持续合成能力是指RT酶与引物/模板结合，延伸，解离这样一个循环所能掺入的核苷酸的平均数目；RTase的持续合成能力比较低 ，通常条件下小于1 kb；所以要继续链的延伸，必需有RTase分子重新结合到引物/模板复合物上 。

• DNA聚合酶活性的保真性是比较低的，RT酶错配率是10^-6～10^-4，而宿主DNA聚合酶错配率是10^-11～10^-7，这主要是由于RT酶缺乏5’-3’和3’-5’外切酶活性。

4RNaseH活性

RNase H活性为病毒生命周期中复制循环所必需；可以降解DNA:RNA杂交链上的RNA； RNase H活性限制了RT酶的合 成长度；我们可以通过RNase H Minus提升cDNA合成长度。

5几种代表性RT酶

常见代表性RT酶有HIV1 RTase、AMV RTase和MMLV RTase。其中，HIV1 RTase是研究最早、最透彻的RT酶；AMV RTase是源自禽成髓细胞瘤病毒 （禽源），该酶的RNase H活性强，合成长度短，合成量低，热稳定性好（42～55℃）；MMLV RTase是源自莫洛尼鼠白血病病毒 （鼠源），该酶的RNase H活性弱，合成长度长，合成量高，热稳定性差（37～42℃）。

02

反转录实验策略

1常规反转录方法与优化的反转录方法

• 常规的反转录体系需要把模板、引物、dNTP、反应缓冲液、RNA 酶抑制剂和反转录酶等组分逐一加入同一PCR管，然后进行反转录。

• 优化的反转录体系（以我们公司AT321产品为例）就是在反应时，只需加入模板RNA和水即可高效合成第一链cDNA。操作简便，降低操作过程中的污染机率。

• 常规的反转录程序需要1.5h，而优化后的反转录程序只需要0.5h（for PCR），或者15min（for QPCR），这样大大节约的时间。

2反转录效率的影响因素

• RNA模板的品质不好会对反转录效率造成一定的影响。

• 常用的反转录引物有Random primer、Oligo(dT) primer和Sequence-specific primer。

Random primer可以随机与模板结合，然后进行反转录；Oligo(dT) primer与真核生物的mRNA的Poly（A）进行有效地结合，然后进行反转录；Sequence-specific primer是针对特定基因设置的引物，多用于一步法荧光定量PCR实验。

当反转录体系中加入引物是Oligo(dT) primer时，如果mRNA模板有些高级结构，那么cDNA合成过程中就会受阻，mRNA上远离3’端的基因和高级结构处的基因序列就无法获得。若在前面的反转录体系中再加入Random primer，那么就可以获得mRNA上远离3’端的基因，但是高级结构处的序列仍无法获得，这个在后面的内容会详细介绍。

• 反转录酶对反转录效率影响主要包括RNase H活性、聚合酶活性的合成能力、RT酶保真性和热稳定性RT酶等等。

RNase H活性在前面内容已有介绍，这里不再赘述；

聚合酶活性的合成能力主要取决于RT酶的动力学范围，它是指对不同浓度RNA模板的RT效率一致时，RNA模板的浓度范围。因此，我们要选择高品质RT酶，这种RT酶的动力学范围宽广，对低浓度RNA可以有效反转，并且对高浓度RNA没有抑制。

RT酶保真性低原因是缺乏3 ’-5’外切酶活性，那么我们可以在RT酶中加入具有3’-5’外切酶活性的蛋白，赋予其校正功能，实现高保真RT-PCR。

RT酶热稳定性提高，可以打开复杂模板中二级结构，cDNA合成继续，但是要求RT酶热稳定性高，这个问题可以通过点突变提高RT酶的热稳定性来解决。

3去除基因组的同时反转录

传统去除gDNA的方法是使用DNase Ⅰ处理，随后再对该酶进行失火，操作繁琐；我们公司目前研发出一款新的酶-gDNA Remover，可以有效地切割双链DNA，但对单连DNA没有作用；所以cDNA合成步骤和DNA去除步骤同时进行，RTase失活和 gDNA Remover失活同时进行。

4microRNA（miRNA）的概述及检测

• microRNA在动植物体内广泛存在，可以抑制特定基因表达，在表达调控中有重要作用；microRNA序列高度保守，长度18 ～ 25 nt。 

• microRNA检测方法有Northern Blot、Micro array、Real-time RT-PCR（qRT-PCR）等。

其中，Real-time RT-PCR（qRT-PCR）实验方法可进行高通量检测，也可检测微量miRNA；可区分前体miRNA与成熟miRNA；可区分单碱基差异；并且易于操作。

qRT-PCR检测microRNA时，可通过miRNA特异引物和miRNA加尾法合成较长的cDNA序列，方便后续基因的检测。

祝大家科研顺利！

全式金技术部 张培培  ▏文

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