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二代测序技术(Next-generation sequencing, NGS)具有高通量、低成本、数据稳定可靠等优点，其在临床精准诊治领域的贡献巨大。科学家通过NGS技术研究发现成百上千与肿瘤相关基因，其中很多肿瘤驱动基因成为治疗的靶点。同时，NGS有发现未知基因变异的优势，可以帮助确定肿瘤的原发部位，通过检测细胞的核酸特征判定是原发癌还是继发癌，进而更好的制定治疗策略。 NGS领域经过了十年左右的发展成熟，逐渐形成以Illumina为领头羊，Thermo Fisher紧追其后的市场格局。Illumina的NGS产品带动测序成本下降，其平台具有高通量、低错误率、低成本、应用范围广等优点。而Thermo Fisher家的头牌产品Ion Torrent系列有测序时间短，但数据产出低，且如果真实序列上同一碱基连续出现，则检测出的碱基数量会有误差等特点。这些技术问题一定程度上限制了Ion Torrent在肿瘤临床精准诊治中的推广应用。 下文将以Illumina Miseq平台为例，给大家介绍NGS技术的基本流程及相关原理：文库构建、DNA簇生成（DNA cluster）、边合成边测序（Sequencing by Synthesis，SBS）等。
文库构建属于上机前样本处理的过程，目的在于将待测的核酸样本转化为测序仪可识别的序列，这种序列有2个特点：（1）线性双链，片段大小在200-300bp左右；（2）含有工具序列，如测序引物结合区、index（区分样本的标签）及P5/P7序列。 以组织样本为例，该流程主要涉及核酸的片段化→末端修复及加A→加接头→Pre-PCR→杂交捕获→Post-PCR→文库等（如图1所示）。其中，杂交捕获是一种常用的目的片段富集策略，并且我们一般在Post-PCR中给目的片段加上index及P5/P7序列。由图示可知，接头序列即为测序引物结合区，此外，接头序列在文库构建过程中，也用作两次PCR引物的结合区。 图1. 文库构建流程图（来源：illumina官网） DNA簇生成的目的在于，将文库片段结合到测序芯片（FlowCell）上，并且通过桥式PCR扩增，达到信号放大的作用。如图2所示，一张Miseq的FlowCell，仅约两指宽，芯片板内刻有微流通道（Lane），且其内表面做了专门的化学修饰，布满与P7/P5序列互补的oligo序列，可使文库单链分子通过簇生成结合上去。 图2 簇生成过程示意图（来源：illumina官网） 桥式PCR技术涉及的具体化学过程如下：文库DNA变性后成单链分子，将其加入FlowCell的Lane中，此时其内表面对应的oligo进行退火，单链文库分子得以杂交结合到FlowCell上（图3-1）。以杂交后的DNA分子为模板，oligo为引物，在聚合酶作用下合成与FlowCell锚定的第一链（图3-2）。之后进行第一次变性，模板链被去除，仅留下新合成的第一链。以合成的第一链为桥式PCR起始模板。模板与FlowCell上相邻的oligo序列通过碱基互补配对形成“桥”（图3-3），以另一端oligo序列为引物等温扩增，形成两条互补链（图3-4）。之后经过变性剂复性进行第二轮桥式PCR（图3-5/3-6）。桥式PCR一般需要35个循环才能够达到足够拷贝数（图3-7/3-8）。一个单一的分子在FlowCell上被扩增形成一个包含单一种类分子的信号单元—簇（Cluster）。在后续谈及的边合成边测序过程中，每个Cluster作为信号收集照片上的一个数据采集单元。 图3 桥式PCR原理示意图 图3 桥式PCR原理示意图（来源：illumina官网） |
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来自： 刘得光3p6n6zqq > 《燃石医学》
