【TIANGEN公开课】Illumina桥式PCR技术

文库的构建→cluster生成→边合成边测序→数据处理。

illumina采用的边合成边测序技术的分子机制，是通过大规模分子簇的方法达到荧光信号检测所需的强度。而获得大规模的分子簇的核心技术即为桥式PCR技术。

桥式PCR的两大基础

1，文库中接头的结构

Illumina测序文库的构建可以说为桥式PCR及测序反应做了充分的准备，待测的DNA分子无论是在长度和结构上都达到了测序的要求，只有两端添加了接头的DNA分子才能够进行边合成边测序反应，这是由接头本身的结构所决定的。

2，Flow cell芯片

Flow cell芯片是桥式PCR发生以及边合成边测序的载体。Flow cell芯片为一张载玻片大小，并含有多个lane。在lane的上下面布满了与支持面共价锚定的oligo序列，简称P5/P7序列，可与接头两端的P5/P7序列形成碱基互补配对，进行桥式PCR反应。

桥式PCR流程详解

带有接头的文库DNA经变性，由双链变为单链。将变性的文库加入flow cell的每个lane中，与flow cell表面的对应oligo进行退火，杂交到flow cell芯片上。以杂交后的DNA分子为模板，以flow cell上的oligo为引物，在Taq DNA聚合酶的作用下合成与flow cell锚定的第一链。之后进行第一次变性，模板链被去除，仅留下新和成的第一链。

以合成的第一链为桥式PCR起始模板。模板与flow  cell上相邻的oligo序列通过碱基互补配对形成“桥”，以另一端oligo序列为引物等温扩增，形成两条互补链。之后经过变性及复性，进行第二轮桥式PCR。

桥式PCR一般需要经过35个循环才能够达到足够拷贝数。一个单一的分子在flow cell上被扩增形成一个包含单一种类分子的信号单元——cluster。在边合成边测序过程中，每个cluster作为信号收集照片上的一个数据采集单元。

桥式PCR之后通过变性线性化DNA，此时每一个cluster中存在两种互补的DNA链，需去除其中的一种DNA单链，保证测序时信号的单一性。同时，通过ddNTP阻断延伸。至此桥式PCR反应已经在flow cell形成cluster测序单元，可以直接用于边合成边测序反应，进行序列的测定。