文章来源：中华骨科杂志, 2016,36(03): 177-183 作者：赵志虎 孟新民 孙晓雷 马剑雄 李风波 李艳军 吕建伟 马信龙
目的 探讨柚皮苷（naringin）对去势大鼠早期骨折愈合中血管形成（angiogenesis & neovascularization）的影响及其机制。 方法 建立去势大鼠胫骨中上1/3骨折模型并随机分为柚皮苷组（300 mg/kg）和对照组。在骨折后2周，进行Microfil灌注，灌注后行Micro-CT扫描，利用HE染色技术从组织学方面评价组织血管化程度，提取骨痂处总RNA，运用Real-time PCR技术定量分析血管内皮生长因子（vessel endothelial growth factor，VEGF）的表达量。同时对骨痂处组织行血管内皮生长因子受体-2 (vessel endothelial growth factor receptor-2, VEGFR-2）免疫组织化学染色，三点弯曲力学试验测量骨痂处最大载荷。
结果
柚皮苷组较对照组的血管体积更大，血管数量更多，血管更密集。组织学切片HE染色结果显示，柚皮苷组相比对照组骨痂单位高倍视野下的血管数量和血管面积增高，差异有统计学意义；RT-PCR结果显示，柚皮苷组与对照组比较可以明显促进VEGF的表达，差异有统计学意义。柚皮苷组骨痂处VEGFR-2阳性细胞数明显高于对照组，差异有统计学意义。柚皮苷组可以明显提高骨痂最大载荷，差异有统计学意义。 结论 柚皮苷可以促进去势大鼠骨折早期愈合过程中的血管形成并增强骨折愈合强度，这可能是通过调节VEGF/VEGFR-2信号通路实现。 随着老龄化社会的到来，骨质疏松症的发生率逐年升高，有研究指出绝经后的女性40％左右患有骨质疏松症，并且有逐年上升的趋势[1,2]。骨质疏松症患者骨折后由于成骨细胞成骨能力减弱以及破骨细胞骨吸收能力增强导致治疗周期长、并发症多和死亡率升高[3,4]，而且老年髋部骨折大多数为骨质疏松所致[5]，这给患者家庭和社会带来沉重的负担。因此，提高骨质疏松骨折的愈合强度以及缩短骨折愈合的时间有着非常重要的临床意义。临床上常用二膦酸盐类药物通过减少骨吸收来减少骨量的丢失，但系统服药周期长再加上患者服药依从性差等缺点而使其效果降低[6,7,8,9]。因此寻求效果明显的提高骨质疏松骨折愈合能力的治疗方案有着十分重要的意义。柚皮苷（naringin，NG），分子式为C27H32O14，是一种双氢黄酮类化合物，广泛存在于番茄、橘、柚等植物中，也是中药骨碎补的主要成分之一。大量实验研究表明，柚皮苷具有多种生物特性，如抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用[10,11]。在体内和体外实验中进一步证明其在治疗血管粥样硬化、心血管疾病、糖尿病、神经退行性疾病、骨质疏松、风湿性疾病中有重要作用[12,13]。本课题组前期实验研究表明柚皮苷可以治疗骨质疏松并可以促进雌激素缺乏引起骨质疏松大鼠骨折的愈合[14]，由于血管形成在骨折愈合早期发挥重要作用，而柚皮苷对于雌激素缺乏骨折愈合时骨痂处血管形成的影响及其机制尚未见报道。本研究采用去势大鼠胫骨中上1/3骨折模型，通过骨密度检测柚皮苷对骨质疏松骨折后骨密度影响以及Microfil灌注技术后Micro-CT扫描定量分析骨折断端血管形成情况以及HE技术观察柚皮苷在骨折愈合过程中血管化的作用，RT-PCR及免疫组织化学染色进一步检测血管内皮生长因子（vessel endothelial growth factor，VEGF）和血管内皮细胞生长因子受体2 (vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2）分子表达情况，目的在于：①探讨柚皮苷促进去势大鼠骨折愈合早期血管形成的作用；②进一步完善柚皮苷在促进骨质疏松骨折愈合中的机制，为临床应用柚皮苷提供证据支持。随着老龄化社会的到来，骨质疏松症的发生率逐年升高，有研究指出绝经后的女性40％左右患有骨质疏松症，并且有逐年上升的趋势[1,2]。骨质疏松症患者骨折后由于成骨细胞成骨能力减弱以及破骨细胞骨吸收能力增强导致治疗周期长、并发症多和死亡率升高[3,4]，而且老年髋部骨折大多数为骨质疏松所致[5]，这给患者家庭和社会带来沉重的负担。因此，提高骨质疏松骨折的愈合强度以及缩短骨折愈合的时间有着非常重要的临床意义。材料与方法 一、实验设备及试剂 柚皮苷（naringin，Sigma公司，美国），Microfil （MICROFIL Silicone Rubber Injection Compounds MV-122 Yellow，Flow tech公司，美国），Micro-CT （Siemens公司，德国），Electro Force 3200力学试验仪（Bose公司，美国）；ALL-in-OneTM Qpcr Mix和All-in-oneTMqPCR （Roche Light公司，瑞士）；双能X线骨密度扫描仪（GE公司，美国）。兔抗大鼠血管内皮生长因子受体-2 (vessel endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2，Abcam公司，英国）。血管内皮生长因子（vessel endothelial growth factor，VEGF）和β-actin引物由北京奥科生物技术服务公司设计并合成。HE染色试剂盒购买自南京建成公司。羊抗兔IgG以及免疫组化试剂盒购自于武汉博士德公司。 本研究中造模在天津医院骨科研究所动物研究室中完成，骨折造模后克氏针内固定。本研究经天津医院伦理委员会审批通过。 二、实验动物及分组 30只健康清洁级雌性SD大鼠（天津市奥臣实验动物销售有限公司），体重（230±20）g，经水合氯醛（0.3 ml/100 g）腹腔注射麻醉，常规消毒后取双侧背侧切口，切除双侧卵巢。术后4周，参照文献[15]的方法建立大鼠右侧胫骨中上1/3横行骨折模型。按随机数字表法随机分为柚皮苷组（300 mg·kg-1·d-1）及对照组（口服等量生理盐水），各15只。所有实验大鼠均采用16号灌胃针进行灌胃给药，居住环境无差别，自由饮食。治疗2周后处死动物，取材及标本处理。 三、取材及标本处理 （一）切片标本处理 柚皮苷组和对照组各取3只大鼠，注射水合氯醛麻醉，心脏采血后分离大鼠右胫骨，剔除肌肉组织后将骨标本浸入体积分数4％的多聚甲醛中固定24 h（室温），转移标本到体积分数10%EDTA溶液中进行脱钙处理，4周后脱水、包埋、切片，用于组织学观察和免疫组织化学染色。 （二）Microfil及Micro-CT标本处理 柚皮苷组和对照组各取3只大鼠，注射水合氯醛麻醉后使用7号头皮针刺入左心室，同时剪开右心耳，进行灌注操作，灌注压为120 mmHg，先使用生理盐水（含肝素5 μ/ml ）进行冲洗后换用体积分数4％多聚甲醛进行固定，触摸下肢肢体变僵硬后再次使用生理盐水（含肝素5 μ/ml）充分冲洗，使用MV Diluent∶MV-122 Yellow∶MV curing agent （4∶5∶0.95 ）配制混匀后进行灌注，灌注速度为3 ml/min，灌注完成后将大鼠下肢标本置于4 ℃过夜，然后将标本置于体积分数15%EDTA中进行脱钙处理2周，进行Micro-CT扫描。 四、检测及数据分析 （一）BMD测定 柚皮苷组和对照组各取3只大鼠处死，取出克氏针，将其放置于骨密度仪检查床上，应用双能X线扫描仪对胫骨骨密度进行测定，采用扫描仪自带的BMD分析软件进行分析，扫面信息区为骨折断端处骨痂矩形区，骨折线位于中央，扫描完成后进行BMD分析。 （二）Micro-CT扫描 电压：80 kV，扫描电压：80 kV，电流：500 μA，扫描分辨率：8.52 μm，旋转角度：360°，扫描时间：2000 ms，帧平均数：6，像素组合：2×2。扫描范围：骨折线上、下各0.5 cm。使用IRW软件重建，计算血管体积/总体积（vessel volume/total volume ，VV/TV），血管厚度（vessel thickness），血管数量（vessel number），血管间隙（vessel sepration）。 （三）组织学观察 切片常规进行脱蜡后，使用苏木精-伊红染液进行染色，光镜下随机选取2组骨折处结缔组织8个高倍视野（×200）拍照，使用IPP软件（Image Pro-Plus Software 6.0）计数骨痂愈合平面单位视野内的血管面积（vessel area）、血管数目（vessel number）进行比较。 （四）免疫组织化学染色 石蜡切片50~60 ℃烤箱中融化30 min后，浸入二甲苯中20 min，梯度酒精水化，采用体积分数3%的H2O2消除非特异性反应后，应用体积分数5％的BSA进行封闭，按照抗体说明书对VEGFR-2进行1∶150稀释，滴加稀释的兔抗大鼠VEGFR-2抗体4 ℃过夜后37 ℃复温1 h，稀释的二抗37 ℃孵育30 min后滴加SABC，镜下DAB显色后蒸馏水洗涤，苏木素复染细胞核，棕黄色颗粒为阳性表达。镜下随机选取10个视野（×20），对阳性细胞数进行统计。 （五）RT-PCR 柚皮苷组和对照组各取3只大鼠，处死后取材。使用组织匀浆器对收集到的各组骨痂标本进行匀浆，按照PCR提取试剂盒说明书进行提取，测RNA的浓度和纯度，按照试剂盒说明书进行逆转录反应以及荧光定量测定VEGF的相对表达量。 VEGF正向引物5'-AGGAGGAGGGCAGAATCATCA-3'，反向引物: 5'-TCTCGATTGGATGGCAGTAGC-3'，b-actin正向引物：5'-AGA TCC TGA CCG AGC GTG GC-3'，β-actin R 5'-CCA GGG AGG AAG AGG ATG CG-3'，逆转录反应体系、PCR扩增体系以及反应条件按照试剂盒说明书设定。反应完成后进行扩增曲线和熔解曲线分析。基因表达量以对照组的初始模板量2-ΔΔCt表示。 （六）生物力学测试 柚皮苷组和对照组各取3只大鼠，处死后取材。力学测试前将标本置于室温条件下30 min，取出各组需加载的标本，两端用骨水泥固定以防止加载时发生旋转移位。将等长的骨标本置于Electro-Force 3200力学试验仪上进行三点弯曲试验。以胫骨中点为加载点，承载点跨距为30 mm，以2 mm/min的加载速度进行加载，记录各组最大载荷（maximum load）。 五、统计学分析 应用SPSS 17.0 (SPSS公司，美国）统计软件包进行统计分析，计量资料采用（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，检验水准α值取0.05。
结果 一、骨密度检测结果 柚皮苷可以促进去势大鼠骨折后骨痂处的骨密度，柚皮苷治疗后2周大鼠骨密度为（130.9±3.2） mg/cm2，对照组为（116.1 ± 3.2）mg/cm2，差异有统计学意义（t=-7.35 ，P<> 二、Microfil灌注结果 Microfil结果显示，与对照组相比，柚皮苷组在骨折治疗2周后形成较多的血管，表现为骨折断端生成更多的血管，血管密集分布在骨折断端（图1）。大体标本显示，柚皮苷治疗组有更为明显、体积更大的骨痂（图2）。 
图1 Microfil灌注后血管图像显示，与对照组（A）相比，柚皮苷组（B）形成较多的血管，表现为骨折断端生成更多的血管，血管密集分布在骨折断端（箭头所示）
图2 大体标本显示，与对照组（A）相比，柚皮苷组（B）有更为明显、体积更大的骨痂（箭头所示） 三、Micro-CT扫描结果 Micro-CT扫描结果显示，柚皮苷组的血管数量、血管体积/总体积明显高于对照组，差异有统计学意义（t血管数量=16.497 ，t血管体积/总体积=23.802，P均<0.05）；柚皮苷组血管间隙小于对照组，差异有统计学意义（t=><0.05）；而血管厚度，柚皮苷组高于对照组，但差异无统计学意义（t=0.624 ，p="">0.05，图3）。 
图3 Micro-CT扫描定量分析显示柚皮苷组的血管数量（A）、血管体积分数（B）明显高于对照组，柚皮苷组血管间隙（C）小于对照组，差异均有统计学意义；柚皮苷组血管厚度（D）高于对照组，但差异无统计学意义 四、HE染色结果 200倍光镜下观察骨痂处血管形成情况，柚皮苷组血管数量明显多于对照组（图4）。Image Pro-plus软件分析显示，柚皮苷组血管数量为（15.88± 3.3）条，对照组为（5.00±1.4）条，差异有统计学意义（t=5.257，P< 0.05，图5a）；柚皮苷组血管面积为（9="" 070±1="" 254）μm2，对照组为（1="" 737±1="" 254）μm2，差异有统计学意义（t="7.162"><> 
图4 柚皮苷处理2周后骨折处骨痂HE染色显示，柚皮苷组血管数量明显多于对照组，箭头所示为新生血管，血管样结构为由内皮组成的环形结构，内有红细胞。A、B分别为对照组、柚皮苷组镜下骨痂整体组织像，C、D分别为对照组、柚皮苷组高倍新生骨痂×200 
图5 柚皮苷处理2周后骨折处骨痂HE染色镜下图像分析，柚皮苷组血管数量（A）、血管面积（B）多于对照组，差异有统计学意义
五、免疫组织化学染色 镜下观察显示，柚皮苷可以明显促进VEGFR-2的表达，其表现为阳性细胞数量明显多于对照组，阳性强度高于对照组（图6）。 
图6 柚皮苷组和对照组骨痂VEGFR-2免疫组织化学染色结果显示，与对照组（A）相比，柚皮苷组（B) VEGFR-2阳性细胞数明显增加×200; C为10个随机视野阳性颗粒数据统计分析结果，相对于对照组，柚皮苷组明显促进VEGFR-2的表达
六、RT-PCR检测结果 与对照组相比，柚皮苷组可以明显提高骨痂中VEGF的表达，柚皮苷组中VEGF的相对表达量为1.15±0.09，对照组VEGF表达量为16.0±1.68，差异有统计学意义（t=-15.132，P<0.001> 七、生物力学测试结果 柚皮苷组的骨痂力学强度强于对照组，对照组最大载荷为（28.83±5.09）N，柚皮苷组最大载荷为（58.24±8.44）N，差异有统计学意义（t= 0.7038，P<>
讨论 骨质疏松是由于多种原因导致的骨微结构破坏和骨强度降低，故骨质疏松症患者发生微骨折机会增加。在去势大鼠骨质疏松骨折后HIF-1α的表达及局部血管密度均明显降低[16]，通过选择性降解△VHL后增加HIF-1α间接促进血管生成可以减少因去势而造成的骨量丢失[17]。因此，研究柚皮苷是否可以通过增加骨折断端血管化进而促进骨折愈合和增加骨强度有着十分重要的意义。 一、柚皮苷促进去势大鼠骨折愈合早期血管形成 本研究发现柚皮苷可以通过促进骨折断端血管形成增加去势大鼠骨折愈合强度，并且其机制可能是通过VEGF/VEGFR-2信号通路实现。我们运用Microfil灌注技术对大鼠进行血管灌注以清晰显示骨折断端血管情况，再进行Micro-CT扫描，定量分析骨折处新生血管。柚皮苷组血管体积和血管体积分数均较对照组增高，血管间隙较对照组降低，这说明柚皮苷组血管数量和血管密度较对照组增加，但血管厚度并未增加，这可能是由于在早期血管形成过程中，新生的血管并未成熟化，2周时间不足以形成较厚的成熟血管。HE染色结果显示柚皮苷组骨痂处血管数量及面积明显多于对照组。 VEGFR-2免疫组织化学染色显示骨痂处新生血管，柚皮苷组可以明显促进骨折处新生血管的形成，这与Microfil灌注结果和HE染色结果一致，均提示柚皮苷可以明显促进骨质疏松大鼠骨折局部血管形成。骨痂最大载荷可以表示骨折愈合的强度，经三点弯曲力学加载后，柚皮苷组最大载荷明显高于对照组，提示柚皮苷可能通过血管生成促进骨折愈合，增强骨折愈合的强度。 二、柚皮苷可以促进VEGF及VEGFR-2的表达增加骨折断端血管形成 绝经后骨质疏松的原因为雌激素的丢失，骨质疏松骨折后早期骨痂的数量及质量明显降低[18]，骨转化加快，既往研究集中在成骨细胞和破骨活性对骨折的影响[19]，而没有考虑到血管在骨折愈合中的作用。近些年来有研究表明血管生成在骨质疏松和骨折中发挥重要作用[20,21]。柚皮苷属于现代中药的范畴，是从中药骨碎补提取出来的类雌激素单体药物。Li等[22]应用不同浓度（60 mg/kg、300 mg/kg、1500 mg/kg）的柚皮苷灌胃治疗去势大鼠，发现柚皮苷可以通过增加骨密度、骨体积和骨小梁厚度，逆转去势引起的骨量减少；且研究发现中等剂量（300 mg/kg）效果最明显，因此本研究采用此剂量为最高剂量来研究柚皮苷对于去势大鼠骨折愈合的影响。 在柚皮苷对于糖尿病大鼠创口愈合的研究中发现，柚皮苷增强伤口部位组织TGF-β1 mRNA的表达，同时VEGF-c与ColⅠ mRNA的表达也上调，提示柚皮苷可能通过上调VEGF的合成来增强伤口部位血管生成[23]。马信龙等[24]通过体外实验证实柚皮苷促进ColⅠ基因的表达，而高浓度的柚皮苷会抑制ColⅠ基因的表达。Li等[25]证实柚皮苷可以预防去势骨质疏松大鼠骨量丢失，其可能是通过促进破骨细胞的凋亡来实现。近些年来血管对于骨折愈合的重要性逐渐受到人们的重视，尤其在骨折早期，增加骨折断端的血液供应可以明显促进骨折愈合。本实验发现在骨质疏松骨折大鼠中柚皮苷可以在骨折早期刺激VEGF的表达，这种血管生成因子可以明显促进血管生成，间接促进骨生成[26]。 VEGF是刺激血管生成最核心的因子，其有VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3三种受体，在促进血管内皮增殖时VEGFR-2发挥重要作用，其中已经证实VEGF/VEGFR-2信号通路在肿瘤血管生成中起重要作用[27]。VEGF与VEGFR-2受体结合后促进血管内皮活化分泌基质蛋白降解酶，使内皮细胞游离到高浓度内皮生长处，促进血管生成[28]。同时VEGF可以刺进成纤维细胞分泌基质，协助新生血管的生成[29]。此外，VEGFR-2还可促进内皮细胞的增殖和迁移，并介导血管通透性的改变，这会在骨折愈合的早期促进骨祖细胞到达骨折断端加速骨的愈合[30]。对骨痂处行三点弯曲力学加载试验，发现柚皮苷组三点弯曲试验时最大载荷明显高于对照组。因此柚皮苷促进骨质疏松骨折愈合的机制不仅是减少骨丢失，而且促进骨质疏松骨折局部早期血管生成。 三、研究的局限性 本实验仅观察并初步探讨了柚皮苷对于骨折早期骨痂血管形成以及骨折愈合强度的影响，对于骨折中、晚期未进行进一步的观察，没有对比不同剂量柚皮苷的效果；另外对于柚皮苷促进骨质疏松骨折愈合的机制需要进一步阐明。因此，需要进一步深入探讨柚皮苷的作用机制及最适剂量。
参考文献（略）
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