干货 | CNS上的生物信息研究是怎么做？（套路解说）

作者：解螺旋.叶子

如需转载请注明来源：解螺旋·医生科研助手

导语

在转录组研究中，研究思路不外乎高通量测序，差异表达分析，选择感兴趣的基因进行功能研究。一般来说实验加生信分析，做到功能预测这一步，可以发个5分左右的SCI。那如果要发CNS级别的文章，要做哪些内容呢？

这里就有篇《Science》上的文章“The STAT3-binding long noncoding RNA lnc-DC controls human dendritic cell differentiation”，主要探究lncRNA在树突细胞（DC）分化及功能中的作用。具体怎么做的呢？回复“science”，下载文献。

第一步，筛选lncRNA

用芯片HTA 2.0 transcriptome microarray assay检测了mono分化至DC过程中(7天)lncRNA的表达变化，在124个显著变化的lncRNA中（fold change>16，p<>

为了保证结果的准确可靠，作者又用二代测序Illumina HiSeq 2000 检测了0点和第7天的lncRNA表达情况，99个lncRNA差异显著(fold>4,FDR<>

取两个结果的交集，筛选出表达倍数高的lnc-DC作下一步研究对象。

接下来为了确保结果准确，要进行验证。

第二步，用Northern blot进行了验证

确证lnc-DC在DC分化过程中的高表达，当然，这步可以不用Northern blot，也可以选择qPCR来做。到这里，就算是找到目标lncRNA了。

然后开始对lncDC的特性进行研究，比如进行基因组定位，序列保守性，全长及结构等方面进行研究。

第三步，lncDC特性研究

基因组定位

这里用到的工具是Genome browser（http://genome./），还可以查看其临近基因，调控邻近基因表达是lncRNA的一种作用机制。

序列保守性

可用PhastCons进行序列保守性估计。

转录起始位点、结束位点及全长验证

可用RACE进行转录起始位点和结束位点及全长验证

结构解析

可用RT-PCR进行5‘端和3’端结构探究，发现lnc-DC有poly A尾和5‘端帽子。

编码能力验证

将lnc-DC转入HEK293T细胞进行表达验证，其无编码能力，同时用生信方法对其序列进行编码能力预测，与实验结果一致。

表达研究

表达特异性作者选取其他免疫细胞进行比对，分别通过实验及数据库中的数据分析，发现lnc-DC只在cDC（conventional DC）中特异性表达。

表达机制研究

组蛋白修饰可调控基因表达，作者采用CHIP-seq和CHIP-qPCR进行组蛋白修饰研究，并通过DNAase I 的敏感性来衡量染色质的疏松状态。

在lnc-DC位点组蛋白H3K4me3和H3K27ac修饰，染色质较为疏松的状态及转录因子PU.1促进了lnc-DC在cDC中的特殊表达。

Lnc-DC功能研究

功能探索

通过RNAi敲除及过表达lnc-DC来研究其功能，敲除和过表达结果相反。敲除lnc-DC后，作者分别从基因、蛋白的表达及功能的影响来考察lnc-DC的功能。

最后表明lnc-DC促进了DC的分化，对DC抗原的递呈及增加T细胞增殖上具有重要作用，同时小鼠体内外实验也有相同结论。

机理研究

在机理研究中，可用排除法，先考察是否和目前已经报道的作用机制一致。

LncRNA的作用机制中，其中有cis顺式调控和trans反式调控。Cis顺式调控影响邻近基因的表达，在之前的实验环节，发现lnc-DC敲除对邻近基因表达没有影响。

接下来用FISH对lnc-DC进行细胞定位，显示lnc-DC处于细胞质中。LncRNA在细胞质中有两种作用方式，可作为ceRNA与miRNA结合恢复mRNA的翻译，或与ALU元件作用促进STAU1介导的mRNA衰退。

RNA免疫沉淀 （RIP）表明lnc-DC不与AGO2作用，排除了lnc-DC和miRNA的作用机制。用生信分析表明lnc-DC没有与ALU的作用序列，所以lnc-DC有新的作用机制。

作者用pull-down（蛋白质体外结合实验）联合MS发现lnc-DC与STAT3（转录因子）相互作用，并用系列实验找出了lnc-DC和STAT3的作用位点及调节方式。

推测的lnc-DC的作用机制模拟图

在mono分化至DC的过程中，组蛋白H3K4me3和H3K27ac的增加伴随着染色质的疏松，促进转录因子PU.1的结合，增强了lnc-DC的表达。lnc-DC转录后即转运至细胞质，与STAT3结合，阻止了SHP1对STAT3的去磷酸化，增强了STAT3的信号通路，最终促进了DC细胞的分化。 在这简单梳理了作者的研究思路，从lncRNA的筛选，验证到功能机理研究。

LncRNA研究方法总结

LncRNA筛选
芯片
Humam transcriptome microarray assay 2.0
Mouse transcriptome microarray assay 1.0

测序
LncRNA验证
Northern blot/qPCR

目标lncRNA研究
基因组定位 Genome browser http://genome./
序列保守性估计PhastCons  http://genome./
转录起始位点，终止位点验证及全长克隆RACE
结构解析PT-pcr
编码能力预测转基因-免疫印迹

LncRNA表达
表达特性
Northern blot/qPCR  
数据库数据

表达机理
组蛋白修饰——CHIP-seq/CHIP-qPCR
染色质状态——DNAase I
序列分析
LncRNA功能
敲除/过表达RNA
免疫印迹（RIP）
Pull down实验