医学里程碑—— 甲氨蝶呤

医学里程碑—— 甲氨蝶呤

　　

        摆在Sidney Farber医生面前的问题未收录医院中医综合科秦雄伟

        在波士顿儿童医院工作的西德尼·法布（Sidney Farber）医生是一位病理学家，1903年生于美国纽约州布法罗市（Buffalo，又叫水牛城）。水牛城与加拿大接壤，是纽约州仅次于纽约市的第二大城。他是第三个孩子，家里有八个兄弟和五个姐妹。法布医生1923年从水牛城大学（University of Buffalo）毕业，然后去德国学了一年医学。回美国后，他进入哈佛大学医学院（Harvard Medical School）学习，并于1927年毕业。他做了一年的病理学实习后，在哈佛大学医学院拿到了一份教职，还在波士顿儿童医院（Children’s Hospital Boston）当上了病理学住院医。一年后，他成为该院的第一个全职病理学医生。[1]

        当时，儿童急性白血病是个大麻烦。这种肿瘤是儿童肿瘤中最常见的，发病儿童年龄多为3岁～4岁，男孩发病率略高于女孩。白血病是因为骨髓中制造白细胞的组织发生了病变。该病伴随有贫血症状。在当时，这种病是百分之百的不治之症，患者在确诊后通常都活不了几个星期。

        法布医生决定解决这种疾病，因为这种肿瘤似乎是可以治疗的。摆在法布医生面前的有几条线索：首先氮芥已经被成功应用于肿瘤治疗，这种药物可以干扰细胞的代谢；其次就是人们发现叶酸可以治疗贫血。叶酸是一种维生素，由英国人露西·威尔斯（Lucy Wills）发现。1937年，露西在印度孟买行医的时候，发现一些怀孕的印度妇女患有奇怪的贫血病。当时在给病患者食用马麦酱——一种黑乎乎的像润滑脂样的酵母菌提取物或者动物肝脏后，她们的病情显示出根本性的好转。进一步的研究表明，这种贫血病是由于食物缺乏、营养不均匀而产生的。后来在1941年，有效成分从酵母菌和菠菜叶中被分离出来，并被取名叫叶酸，当时还不知道这种化合物的结构。露西发现的这种贫血病也被称作叶酸缺乏性贫血——因叶酸缺乏导致骨髓中的组织发生了病变而贫血。

        与此同时，纽约西奈山医院在建立肿瘤动物模型时应用了各种使细胞快速生长的物质，其中一种就是肝脏提取物。之后，肝脏提取物的提供者Lederle实验室直接提供了较纯的一系列叶酸的衍生物并认为这就是“叶酸”。西奈山医院的实验员们把这些“叶酸”给动物食用以让肿瘤生长得更快些，结果让他们大跌眼镜，这些叶酸并没有促进反而抑制了肿瘤细胞生长。他们还不知道，给动物食用的并不是叶酸而是叶酸的结构类似物、叶酸的拮抗剂。研究者也并没有认识到，肿瘤的快速分裂是叶酸提供了合成DNA的原料。[2]

        得到这个结果，研究者认为细胞正是因为缺少了叶酸才导致不断的增殖，因为细胞增殖失去控制了。现在看来这是个似是而非的结论。尽管感觉奇怪，研究人们还是很庆幸——毕竟有治疗肿瘤的药物了。

        法布医生想，这下无论理论上还是动物实验的数据都具备了。接下来就是用叶酸在患者身上试验。他和Lederle实验室取得了联系，想办法得到了一些叶酸，请注意，这回是真正的叶酸了。实验结果不难想象：十几个孩子的骨髓里充满了大量未分化的细胞，癌症“加速了”。我们可以想见医生当时遭受了多么大的负罪感和挫折感。尽管如此法布医生还是把失败当成一种机会，一切从头开始：给予肿瘤患者肝脏提取物和叶酸都可以治疗贫血或者使肿瘤增大，那么叶酸就能够促进细胞增殖；如果细胞缺少叶酸，那么细胞的增殖应该被停止。叶酸可能被其他的药物拮抗了，这些药物没准就是和叶酸结构相同的化合物。

        1945年，在Lederle实验室工作的印度人萨巴柔博士（Yellapragada Subbarow）领导的团队化学合成了叶酸，也算是对露西在印度发现叶酸的回报。法布医生马上和萨巴柔又取得了联系，让他再提供一些叶酸的类似物，而萨巴柔恰好正在试制这种药物。真是无巧不成书，法布医生取得了氨蝶呤（aminopterin）——甲氨蝶呤（Methotrexate，MTX）的前体，于1947年11月展开了临床试验。临床试验中包括了十六个年少的白血病患者。其中十个人在服药后癌症得到了好转，有几人的肿瘤甚至消失了。

        法布医生把这个成果发表在一九四八年六月的《新英格兰医学杂志》（New England Journal of Medicine）上。这是历史上第一次人类设计的药物治愈了急性淋巴细胞性白血病。按理说，同行业人士应该对此成果表示赞赏。可事实上，同行业人士对此成果反应相当冷淡或者是不友好的：人们不太相信这样一个年轻的、实验经费困乏的、技术陈旧的病理科医生会研制出什么“治愈”白血病的药物。在20世纪40年代，美国癌症研究的主要出资人是一对从事广告业的夫妇：Lord＆Thoumas公司的董事长及其    夫人。这样的躁动的氛围中似乎有这样的现象也不奇怪了。[3]

    MTX随后的发展轨迹似乎一帆风顺但更为曲折，人们并没有从整件事中学到什么。人们从开始的不屑很快发酵成依赖和迷信，甲氨蝶呤同氮芥一样被寄予了太高的希望，人们合成出大量一系列含氮化合物随机筛选，而不是从理智的角度分析其有效的原因。大量的人员、大量的经费被投入到“抗癌战争”中，随后的三十几年里，这场战争不断升级，直到20世纪80年代才逐渐冷却。此外，在类风湿领域尽管Gubner在1951年成功应用氨蝶呤治疗了类风湿关节炎与银屑病。但在当时甲氨蝶呤还是被认为是抗代谢的抗癌药物，自然而然的人们认为它的毒性还是太大了。另外一个原因是激素的出现，导致几乎所有的注意力都集中在激素治疗上。在风湿病领域只有少数研究者包括Rex Hoffmeister等几个人开始用小剂量MTX治疗自身免疫疾病。

MTX用于类风湿——Michael Weinblatt的回忆录

        时间很快就来到了20世纪80年代，当时类风湿关节炎的治疗已经从阿司匹林这样的非甾体消炎药慢慢切换到慢作用抗风湿药物上。当时主要的抗风湿药包括金制剂、羟氯喹等等还包括一些免疫抑制剂。人们事实上还是拿类风湿关节炎没办法，当病情控制不佳时住住院、做做物理治疗或者用激素。而当时新的治疗手段包括一些损伤性大的疗法基本上是不成功的。这就是当时的事实。

        韦恩布拉特医生（Micheal Weinblatt）在1980年完成了他的实习后对MTX治疗类风湿关节炎的研究产生浓厚兴趣。他的实验小组的各个成员都对MTX充满热情。他们的信念就来源于1951年Gubner对银屑病和类风关患者所做的实验。1982年韦恩布拉特医生写了一份实验方案给MTX的生产者，也是一开始提供给法布医生MTX的Lederle实验室。几周后Lederle实验室称目前对支持这个研究无兴趣，但是他们会保留开始这个方案的权利。大约6个月以后，Lederle实验室给他打电话问他是否能够参加讨论试验方案。

        韦恩布拉特医生在回忆录中写到：他们（Lederle实验室）为什么改变主意来支持这个实验到现在也不能理解：MTX并不是专利药，基本无利可图。参与讨论的各个专家提出了各自的意见，后来这些人的研究也基本印证了他们在会议上的立场。一共有三组人马在进行同样的研究，一组就是布拉特和他的同事，另外的两组分别是风湿病系统合作研究项目（CSSRD）的负责人Jim Williams和Albany医学院的Joel Kremer。其他的参与者有Sarah Morgan，后来首次应用叶酸控制甲氨蝶呤肝毒性的人；Harriet Kiltie，一直关心甲氨蝶呤肝、肺损害；Bruce Cronstein，则一直探索甲氨蝶呤治疗风湿的机理。[4]从那时起关于甲氨蝶呤与类风关之间的关系的报道慢慢多了起来，直到现在我们还能在各种研究期刊上看到他们的文章。

    会议最后决定开展一个35个病人、24周、安慰剂对照的临床实验。Lederle实验室出经费（9万3千美元）提供实验所需药品和安慰剂空白药片。实验从1983年开始到1985年结束并发表结果。FDA于1988年批准MTX用于治疗自身免疫疾病。

    如果说甲氨蝶呤的发现过程充满一波三折，用于治疗RA的适应症的批准似乎是经过漫长的波折后的水到渠成。MTX开发的整个过程为药物研究提供了很好的范例。正如Cronstein教授在其2000年出版的书中所说：MTX是革命性的进展，首先，它是第一个分子水平的药物，MTX的研制是理性化疗药物设计的开端。其次，MTX是第一个治疗银屑病的系统性用药，也是治疗严重银屑病的安全有效的药物。随后小剂量的MTX转入到RA的治疗中，几乎没有任何一个治疗RA的新药的临床实验（35个病例）能与MTX相比。MTX尽管已经合成了半个世纪，它还是不断地为医学界带来惊奇，不仅是新的应用还包括新的作用机理。

MTX的作用机理

    MTX一开始就是被用于治疗白血病，所以它对频繁增殖的细胞有抑制这一点也毫不奇怪。许多开始将MTX应用在风湿治疗的医生们也是这样理解的。随着时间的推移越来越多的治疗机理被发现，同时人们对细胞的本质也有了更深的了解。临床和实验室的数据被反反复复地相互引用、分析和借鉴，更加积累了关于MTX的知识。不仅如此，研究者们通过MTX了解了更深层次的疾病知识，这在众多药物中是不多见的。

MTX的细胞增殖抑制作用

    毫无疑问的，不论是大剂量还是小剂量。MTX都是二氢叶酸还原酶的抑制剂，阻止二氢叶酸还原为活化的四氢叶酸,使胸腺嘧啶核苷酸和嘌呤核苷酸的合成原料耗竭，抑制DNA和RNA的合成,MTX必然有细胞抑制作用。从肿瘤研究来说，MTX属细胞周期特异性药物，主要作用于S期，使细胞停留在G1/S转换期。MTX作用方式如图所示，在水溶液和结合部位上，MTX通过中间的柔性部位折叠，一端的喋呤基和另一端的谷氨酸基“夹”在α卷曲上。

    但是现在有许多的现象说明MTX治疗RA不仅通过细胞毒的作用：① 有部分临床医生为了减少MTX的毒性，给RA患者服用小剂量MTX的同时，也给予叶酸，这种给药方式并没有明显影响MTX的疗效。② 体外实验中MTX细胞抑制的最小剂量1.0uM在体内并不能达到。③ 每周一次小剂量(7.5mg~20mg)的给药方式，使MTX在体内的有效血浓度维持很短的时间，并不能解释MTX通过常规的机制，即通过细胞毒作用抑制免疫细胞的增殖而达到疗效。这些都提示MTX治疗RA依赖于其他的方式。

MTX通过腺苷诱导免疫抑制作用

    由Cronstein等人首先发现MTX预处理过的细胞外有高浓度的腺苷，在动物风湿模型中，腺苷受体拮抗剂使MTX的抗风湿作用完全消除，除此以外，在A2、A3受体敲除的小鼠模型中，MTX表现无抗炎作用。[5]

    MTX被认为是嘌呤合成的抑制剂，在嘌呤的合成过程中，MTX抑制5-氨基咪唑-4-羧基酰胺核糖核苷酸(5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide, AICAR)的甲酰基转移酶，导致AICAR堆积，AICAR通过抑制5`-单磷酸腺苷脱氨酶及腺苷脱氨酶的活性，从而抑制5`-单磷酸腺苷及腺苷的降解，使细胞内外的5`-单磷酸腺苷及腺苷增多；而且多种免疫活化细胞表面的CD73能将5`-单磷酸腺苷转化为腺苷，进一步增加腺苷的含量[6]。N P Riksen等人实验检测了由腺苷引起的前臂血流量（FBF）变化，并检测了腺苷脱胺酶的活性，发现淋巴细胞（单核细胞）的Vmax降低、Km值无明显变化，而红细胞Vmax和Km则无变化。说明MTX是此酶的非竞争性拮抗剂，红细胞由于无嘌呤合成功能，不存在AICARiboside，故Vmax与Km不变[7]。

    研究者们认为，MTX可能通过其衍生物多谷氨酸化MTX达到其持续抗炎免疫的作用，当多聚谷氨酸态形成后可以更牢固地结合叶酸依赖酶，同时更容易留在细胞内。无论MTX还是四氢叶酸均需要进行多聚谷氨酸反应才能与AICARFT结合，有趣的是，二氢叶酸的多聚谷氨酸态对此酶同样具有抑制作用，抑制效果与同样谷氨酸化的MTX活性相似[8]。

    很多细胞的表面都存在跨膜的腺苷受体，主要分为A1、A2α、A2β及A3，细胞外腺苷能和这些受体结合，产生不同的生物学效应。目前的研究认为，腺苷与腺苷受体A2、A3的结合可使炎症细胞产生免疫抑制作用[9]。

    腺苷与巨噬细胞膜上的A2α受体结合，导致细胞内环磷酸腺苷分泌增多，从而抑制巨噬细胞的吞噬作用，并抑制前炎症因子肿瘤坏死因子（TNF）、γ-干扰素（IFN-γ）、白介素-2（IL-2）、白介素-12（IL-12）的分泌及基因表达，同时可促进抗炎因子IL-6、IL-10的分泌。腺苷与淋巴细胞膜上的A2α、A3受体结合也可抑制淋巴细胞的增殖并减少其分泌TNF、IL-8、IL-12及IFN-γ[10]。在大鼠佐剂关节炎模型中当敲除A2α、A3受体后发现MTX并不能导致诸如IFN-γ等信号因子的分泌，提示MTX主要的靶点为A2α、A3受体。[11]

    但是，MTX的“腺苷假说”还存在许多解决不了的问题。首先，腺苷的半衰期太短了，在体内仅存在几分钟，如何能够介导如此长时间的抗炎作用是一对矛盾。其次，正如上面所述，特异性的AICARFT抑制剂并没有抗炎作用。[12]

抑制多胺的生成

    也有一些学者把目光转移到其他方面。RA患者的滑膜组织和单核细胞中（PMBC）均发现有多胺的蓄积。多胺可被单核细胞转化为淋巴细胞毒素，MTX作为二氢叶酸还原酶的抑制剂可减少四氢和甲基四氢叶酸的形成，这二者通常作为甲基供体促进形成蛋氨酸和S -腺苷甲硫氨酸，最终形成多胺。因此，MTX具有间接抑制多胺形成的作用。但是，转移甲基化抑制剂3脱氮腺苷（3-deazaadenosine）并未表现出临床疗效。低剂量MTX还可以防止这些细胞产生过氧化物，如果合用甲硫氨酸MTX的效果还会增强但可被四氢叶酸消除。[13]

    MTX就其本质来说是一种叶酸拮抗剂，通过抑制叶酸依赖酶发挥作用。叶酸系统是一类存在于细胞中具有广泛功能的甲基供体系统，由于该系统的复杂性使甲氨蝶呤具有多种功能来介导抗炎因子的产生与炎症因子的抑制。有趣的是，仅有结构上类似甲氨蝶呤的叶酸拮抗剂才具有抗风湿作用。我们猜测，其机理应该包括腺苷的堆积以及抑制多胺的形成，但是不能排除是否存在其他因素的作用。同时，如果拮抗腺苷或单独应用多胺的拮抗剂其抗炎作用大大降低或不具备抗炎作用。对于这种情况的解释只能是这两种作用相互协同。

        MTX在当前与未来

        MTX代表了一类化合物，人们希望这类化合物在肿瘤治疗和RA治疗中起到更大更安全的作用，现在进入临床的叶酸或MTX的类似物药物已经达到了十几个。遗憾的是，目前没有一个化合物达到相同的浓度—效应比，也没有一种药物能够延续MTX在RA治疗上的有效性。这不禁又让我想起了法布医生所说的一段话：“我们不能等待对癌症的透彻理解,我们没有必要为了在癌症治疗方面取得巨大进展而追求在基础研究领域对所有问题都获得圆满的答案。在人类医学史上有很多案例,人们往往在获得成功疗法以后几年、几十年甚至几个世纪才理解治疗机制,比如牛痘、洋地黄、阿司匹林都是如此。”时至今日，Cronstein教授在今年3月的《Nature Review Rheumatology》杂志上撰文，对MTX究竟如何起作用提出进一步的疑问。显然，完全认识MTX的作用还需要一段时间[14]。

        近20多年来，MTX已成为类风湿关节炎的基石用药（anchor drug）。美国风湿病学会（ACR）在2008年指定的“治疗类风湿关节炎推荐”中将MTX与来氟米特共同列为一线用药，无论病情轻、中、重；病程早、中、晚以及预后的好与坏均应首先考虑应用此两种药物。目前包括生物制剂在内的所有治疗RA的药物还没有一种药物的疗效显著优于MTX。

        21世纪是生物学的世纪，随着后基因组时代的到来，人们通过多种“组学”的帮助可以更加深刻地理解生命的现象。各种叶酸依赖酶组织在一起形成复杂的叶酸代谢系统，多种生命活动通过叶酸系统组织起来。MTX及其类似物或专一的、或多靶点的抑制叶酸依赖酶使细胞呈现各种不同的状态，能够从事这种研究无疑是令人着迷的。而对于MTX其本身来说，如何提高MTX的安全性及病人的依从性则是另一个更为重要而紧迫的研究方向。可以想见的是MTX在新的世纪里似乎还要陪伴我们探索更多的未知领域。

（作者：李秋实）