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“辨证论治”是中医学的基本特点，“方证相应”是中医理论的精髓。中药药效物质基础是指中药中含有的能够表达药物临床疗效的化学成分总称。由于中药的化学成分复杂，而有单味中药配伍的中药复方（方剂）不同成分之间相互作用以及产生的变化更为复杂，想要揭示中药复方中真正起效的成分成为了一道难题，而中药复方药效物质基础的研究成为了中药现代化的关键性问题。中医方证代谢组学是将中药血清药物化学和代谢组学有机结合，在解决证候生物标记物的基础上，建立方剂药效生物评价体系，进而发现与临床疗效直接相关的药效物质基础，阐明作用机制的方法学体系。 老年痴呆症（Alzheimer'sDisease，AD）又称阿尔兹海默病，是一种慢性神经系统退行性疾病。老年痴呆症不仅严重影响人类的身体健康和生活质量，同时也给患者家庭和社会带来沉重负担。AD是一种复杂性疾病，其发生发展是一种连续的病理生理过程，由于其发病的不可逆性，AD基础和临床研究的时间点应该前移。开心散是中医益智、安神定惊、治疗健忘的基本方，是治疗痴呆的经典方剂。现代药理研究结果证明，开心散四味药材均能在不同程度上起到益智的作用，开心散对老年痴呆症的治疗有多靶点、多方位的优势，但开心散治疗老年痴呆症的药效物质基础及作用机制仍然不清楚。因此，有必要对开心散干预老年痴呆症的机制及药效物质基础进行评价及探讨。 1 材料 1.1 实验药品与试剂 生晒参Panaxginseng C. A. Mey.、茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf、远志Polygala tenuifolia Willd.、石菖蒲Acorustatarinowii Schott.均购于北京同仁堂药店。 无水氯化铝（分析级，天津市光复精细化工研究所），D-半乳糖（合肥Biosharp生物科技公司），戊巴比妥钠粉末（上海化学试剂采购供应站），蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司），乙腈（色谱级，德国Merck公司），甲醇（色谱级，美国Fisher公司），甲酸（色谱级，天津科密欧化学试剂有限公司），亮氨酸脑啡肽（美国Sigma公司）；实验所用其它试剂均为分析级。 1.2 实验动物 Wistar大鼠，雄性，体质量260±20g，由黑龙江中医药大学动物实验中心提供，许可证号：P00102004。室温饲养，动物自由摄食饮水。 1.3 实验仪器 Morris水迷宫（中国医学科学院药物研究所）；AcquityTM UPLC液相色谱仪（四元梯度泵-在线真空脱气机-自动进样器-二极管阵列检测器-柱温箱）；SynaptTM G2-Si质谱分析系统（高分辨四级杆串联飞行时间质谱仪）。 1.4 供试品制备 1.4.1 开心散冻干粉的制备 按原方比例，即人参：茯苓：远志：石菖蒲=3：3：2：2，称取药材粗粉，混匀。用6倍量70%乙醇加热回流提取2次，每次2h，合并滤液，浓缩，并用冷冻干燥法干燥，得疏松粉末。 1.4.2 开心散灌胃溶液的制备 取开心散冻干粉溶于蒸馏水中，配制成生药浓度为0.54g·mL-1的开心散灌胃溶液，以10mL·kg-1的剂量灌胃治疗。 1.4.3 开心散体外成分分析样品制备 取开心散冻干粉适量，加入10倍量50%甲醇混匀，超声10min，在13000rpm、4℃条件下离心10min，取上清液过0.22μm的微孔滤膜。 1.4.4 开心散体内成分分析样品制备 取空白血清和含药血清各2mL，缓慢通过已活化的WatersOASIS固相萃取柱，用甲醇3mL洗脱，收集洗脱液氮气流吹干，残渣以200μL甲醇定容，混悬震荡60s，在13000rpm、4℃条件下离心10min，取上清液。 2 实验方法 2.1 实验分组及设计 将Wistar大鼠随机分为空白对照组10只，AD模型组1-4组各10只，开心散干预（KXS）组1-4组各10只。AD模型组以及KXS组大鼠每日灌胃给予氯化铝（AlCl3）28mg·kg-1。同时腹腔注射D-半乳糖（D-galactose，D-gal），每日注射剂量为63mg·kg-1，共90天。空白对照组每天给予等量生理盐水。 空白对照组于实验第85天，AD模型1-4组、KXS组1-4组分别于实验第10、40、55、85天，进行6天的Morris水迷宫实验，并于行为学实验后进行尿液、血液的采集。 2.2 Morris水迷宫行为学评价 2.2.1 定位航行实验 定位航行实验用于测量大鼠的学习能力，实验历时5天，从第1天起，每天于同一时间训练大鼠。首先将池水用奶粉搅拌成奶白色以便掩盖平台，训练时水面高出平台2cm；利用软件将水迷宫分成4个象限，每天分别在四个象限的固定位置大鼠面向池壁放入水中，记录其寻找并爬上平台所需的时间（潜伏期），每次学习时限60s；若大鼠在60s内未找到平台，须利用标杆将其引至平台，此时潜伏期记为60s。 2.2.2 空间搜索实验 空间探索实验用于评价大鼠学会寻找平台后对平台空间位置记忆的能力，于定位航行实验后，在第6天撤除水下平台，于4个象限内随机选取一入水点，记录其在60s内跨过原平台相应位置的次数。 2.3 生物样本采集及处理方法 尿液样品于4℃，13000rpm 离心15min后取上层清液，蒸馏水稀释一倍，振荡，过0.22μm的微孔滤膜。大鼠3%戊巴比妥钠麻醉，取血清备用。 2.4 尿液代谢组学数据采集 色谱分析条件：色谱柱：ACQUITYUPLCTM HSS T3 column（100mm×2.1mm i.d.，1.8μm）；流动相：A为0.1%甲酸乙腈，B为0.1%甲酸水；柱温预设：45℃；流速：0.4mL·min-1；进样体积：2μL；梯度洗脱程序为：0-2.5min，1%-11% A；2.5-4.5min，11%-21% A；4.5-7.0min，21%-40% A；7.0-8.5min，40%-99% A；10.5-10.6min，99%-1% A；再平衡1.5min后采集下一样品。质谱分析条件：电喷雾离子源（ESI）；正负离子扫描模式：脱溶剂气流量：800L·h-1；脱溶剂气温度：450℃；离子源温度：110℃；锥孔电压：20.0V；毛细管电压：3.0kV；锁定质量溶液：采用美国Waters公司Lockspray校正系统进行在线质量校正，亮氨酸-脑啡肽（Leueine-Enkephalin，[M+H]+=556.2771，[M-H]-=554.2771），溶液浓度为1ng·mL-1，流速为5μL·min-1；质量扫描范围：m/z 50-1000 Da，扫描时间0.2s；工作站：MassLynx V4.1工作站。 2.5 开心散体内外化学成分数据采集 色谱分析方法：色谱柱：ACQUITYUPLCTM C18 column（100mm×2.1mm i.d.，1.7μm）；流动相：A为0.1%甲酸乙腈，B为0.1%甲酸水；柱温预设：45℃；流速：0.4mL·min-1；进样体积：3μL。梯度洗脱程序为：0-1min，2%-20% A；1-4min，20%-21% A；4-6.5min，21%-30% A，；6.5-9.5min，30%-35% A；9.5-14min，35%-50% A；14-16min，50%-52% A；16-16.5min，52%-82% A；16.5-19min，82%-83% A；19-19.5min，83%-100% A；19.5-20.0min，2% A。质谱分析方法：毛细管电压正离子扫描为3.0kV，负离子扫描为2.8kV，脱溶剂温度为350℃，采样锥孔电压为30V，离子源温度为110℃，脱溶剂气流量为600L·h-1。质谱数据在全扫描方式下用MSE模式进行采集，低碰撞能为6V，高碰撞能为20-40 V，质量扫描范围为50-1500Da，扫描时间为0.2s。 2.6 数据处理 2.6.1 统计学处理 统计结果以均数±标准差（）表示，数据进行独立样本t检验。P<>认为有显著的统计学差异。 2.6.2 代谢组学数据处理 将得到的尿液UPLC-MS数据输入ProgenesisQI软件进行化合物鉴定和多变量统计分析。对各组不同时间点数据进行非监督型主成分（Principal Components Analysis，PCA）分析。同时对各组所获得信息数据进行统计学分析，比较模型组和空白组各离子含量差别是否具有统计学意义，筛选出这些差异离子（P<>）作为潜在生物标记物集合。对潜在的标记物，将得到的保留时间和质核比数据，结合软件中化合物鉴定功能与代谢产物数据库（HMDB）搜索，对这些差异离子进行初步确认。再通过UPLC-MS/MS技术对潜在的离子进行二级数据扫描，通过碎片信息及其可能的裂解方式进行匹配，鉴定或表征各潜在生物标记物。 2.6.3 开心散体内外化学成分分析 运用UNIFI天然产物整体解决方案，以UPLCMS采集的MSE数据为基础，将高低碰撞能下获得的准分子离子和碎片离子与UNIFI中药数据库进行匹配，对药材来源及入血的开心散原型成分进行快速解析。并对其入血后的代谢成分进行表征，该软件通过质量短缺过滤技术（MDF）结合MassFragment TM模块智能地进行母药和代谢产物的二级碎片解析，进行结构确认，并给出详细的化合物可能的生物代谢转化及化学元素组成。 2.6.4 相关性分析 运用代谢标记物与血清化学成分相关性分析方法（Plotting of Correlation Between Marker Metabolites and SerumConstituents，PCMS）对血清中外源性开心散成分与内源性标记物两组变量关联度分析，提取与内源性标记物高度关联的开心散入血成分作为防治AD的潜在效应物质。将开心散入血成分群与生物标记物含量变化矩阵导入PCMS软件。实验设置0.7≤|r|≤0.75为高度正（负）相关，0.75≤|r|≤1为极度正（负）相关；入血成分与生物标记物相关的个数的达到6个及以上，认为该入血成分为潜在效应物质。 3 实验结果 3.1 Morris水迷宫行为学评价 3.1.1 定位航行实验评价 定位航行实验结果显示，在训练第5天，与空白对照组大鼠相比，AD模型第4组大鼠的逃避潜伏期时间显著延长（P<>）。与模型组第4组大鼠相比，KXS第 4组大鼠逃避潜伏期时间显著缩短（P<>）。具体结果见图1。 图1 开心散对AD模型不同阶段大鼠Morris水迷宫定位航行实验的影响 注：与空白对照组比较，*P<>，**P<>；与模型组比较，#P<>，##P<>；A：第1组，第10-14天；B：第2组，第40-44天；C：第3组，第55-59天；D：第4组，第85-89天。 3.1.2 空间搜索实验评价 空间搜索实验结果显示，与空白对照组大鼠相比，模型第4组大鼠经过有效区域次数有显著差异（P<>）。与模型第4组大鼠相比，KXS第4组大鼠穿越平台次数显著增加（P<>）。具体结果见图2。 图2 开心散对AD模型大鼠Morris水迷宫空间搜索实验的影响 注：与空白对照组比较，*P<>，**P<>；与模型组比较，#P<>，##P<>。 3.2 代谢组学结果 对各组尿液样本数据分别进行PCA分析，发现在复制模型的进程中，AD模型组数据轮廓开始逐渐远离空白组，而开心散给药组有向正常对照组回调的趋势。各阶段PCA score-plot图见图3。对于所得化合物通过搜索代谢产物数据库（HMDB），对差异离子（P<>）进行初步确认。结合二级质谱碎片信息，鉴定或表征各潜在生物标记物。根据以上步骤，AD造模过程第15天尿液中共鉴定出35个潜在的生物标记物（表1），开心散对其中31个具有调节作用；AD造模过程第45天尿液中共鉴定出48个潜在的生物标记物（表2），开心散对其中34个具有调节作用；AD造模过程第60天尿液中共鉴定出40个潜在的生物标记物（表3），开心散对其中29个具有调节作用；AD造模过程第90天尿液中共鉴定出42个潜在的生物标记物（表4），开心散对其中22个具有调节作用。 图3 空白组、AD模型组以及开心散给药组大鼠尿液PCA分析后的Scoreplot图 注：（1）第15天：A.正离子模式B.负离子模式；（2）第45天：C.正离子模式D.负离子模式；（3）第60天：E.正离子模式F.负离子模式。 续图3 空白组、AD模型组以及开心散给药组大鼠尿液PCA分析后的Scoreplot图 注：（4）第90天：G.正离子模式H.负离子模式。 表1 开心散干预AD模型复制第15天大鼠尿液潜在生物标志物回调趋势表 注：↑↓Maker相对含量在模型组中上升或者下降趋势；+ or-药物回调或者没有回调作用；与模型组比较，#P<>，##P<>。 表2 开心散干预AD模型复制第45天大鼠尿液潜在生物标志物回调趋势表 注：↑↓Maker相对含量在模型组中上升或者下降趋势；+ or-药物回调或者没有回调作用；与模型组比较，#P<>，##P<>。 表3 开心散干预AD模型复制第60天大鼠尿液潜在生物标志物回调趋势表 注：↑↓Maker相对含量在模型组中上升或者下降趋势；+ or-药物回调或者没有回调作用；与模型组比较，#P<>，##P<>。 表4 开心散干预AD模型复制第90天大鼠尿液潜在生物标志物回调趋势表 注：↑↓Maker相对含量在模型组中上升或者下降趋势；+ or-药物回调或者没有回调作用；与模型组比较，#P<>，##P<>。 3.3 开心散血中移形成分分析 利用UNIFI软件结合中药数据库，发现开心入血的原型成分以及药物代谢产物。确认了AD大鼠口服开心散后血中移行46个成分原型成分（表5），其中14个来源于人参的人参皂苷类成分，13个来源于茯苓的三萜酸类成分，18个来源于远志的寡糖酯类和呫吨酮类成分，1个来源于石菖蒲。以及20个代谢产物（表6），其中1个来源于人参，14个来源于远志，5个来源于茯苓。 表5 AD模型大鼠口服开心散后血中移行成分（原型）
注：a.人参，b.茯苓，c.远志，d.石菖蒲。 表6 AD模型大鼠口服开心散后血中代谢产物
注：a.人参，b.茯苓，c.远志，d.石菖蒲。 3.4 潜在效应物质分析 采用PCMS分析方法计算66个血中移形成分与AD发展不同阶段效应标记物的相关系数，结果见Heatmap图（图4）。开心散干预的尿液生物标记物与体内显效成分关联性分析结果显示：第15天（图4A）开心散的血中移行成分中，18个为高度相关成分，其中，4个来源于茯苓（包括茯苓新酸C，25-甲氧基茯苓新酸，去氢齿孔酮酸，3β,16α-二羟基羊毛甾-7,9(11),24-三烯-21-酸），3个来源于人参（包括丙二酰基人参皂苷Rb1，人参皂苷Ra2，丙二酰基人参皂苷Rd），11个来源于远志（包括乙酸苯酯，3-羟基-2,8-二甲氧基讪酮，6-羟基-1,2,3,7-四甲氧基讪酮，远志讪酮Ⅰ，1,7-二甲氧基-2,3-亚甲二氧基讪酮，6,8-二羟基-1,2,3-三甲氧基讪酮，1,2,3,7-四甲氧基讪酮，西伯利亚远志糖A6，西伯利亚远志咕吨酮A/B，远志讪酮Ⅲ葡萄糖醛酸化代谢产物，去乙基远志讪酮Ⅰ葡萄糖醛酸化代谢产物）；第45天（图4B）的血中移行成分中，22个为高度相关成分。其中，7个来源于茯苓（包括茯苓新酸AM，茯苓新酸F，25-甲氧基茯苓新酸，去乙基茯苓新酸E代谢产物，去乙基茯苓新酸C代谢产物，去乙基土莫酸葡萄糖醛酸化代谢产物，茯苓新酸F脱水代谢产物），9个来源于人参（包括人参皂苷Rb2，人参皂苷Rb1，人参皂苷Ra2，丙二酰基人参皂苷Rd，三七皂苷R1，20-O-葡萄糖基人参皂苷Rf，人参皂苷Rf，人参皂苷Ro，人参皂苷Rb1 脱水代谢产物），6个来源于远志（包括乙酸苯酯，6-羟基-1,2,3,7- 四甲氧基讪酮，6,8-二羟基-1,2,3-三甲氧基讪酮，E-3,4,5-三甲氧基肉桂酸脱水代谢产物，远志苷D脱水代谢产物，去乙基远志讪酮Ⅱ葡萄糖醛酸化代谢产物）；第60天（图4C）的血中移行成分中，27个为高度相关成分，其中，6个来源于茯苓（茯苓新酸G、25-羟基茯苓新酸C、茯苓新酸B、茯苓新酸D脱水代谢产物、25-甲氧基茯苓新酸、去乙基茯苓新酸C代谢产物），5个来源于人参（丙二酰基人参皂苷Rc、人参皂苷Ra2，丙二酰基人参皂苷Rd，三七皂苷R1，人参皂苷Rb1脱水代谢产物），16个来源于远志（1,7-二甲氧基-2,3-亚甲二氧基讪酮、西伯利亚远志糖A3、西伯利亚远志糖A5、西伯利亚远志糖A6、西伯利亚远志糖A1、西伯利亚远志咕吨酮A/B、远志讪酮Ⅲ、α-D-（6-O- 芥子酰基）-吡喃葡萄糖基（1→2）-β-D-（3-O-芥子酰基）-呋喃果糖、远志苷A、远志次皂苷、去乙基E-3,4,5-三甲氧基肉桂酸、去乙基E-3,4,5-三甲氧基肉桂酸葡萄糖醛酸化代谢产物、远志讪酮Ⅲ葡萄糖醛酸化产物、远志讪酮Ⅰ葡萄糖醛酸化代谢产物、去乙基远志讪酮Ⅱ葡萄糖醛酸化代谢产物、6-羟基-1,2,3,7-四甲氧基讪酮葡萄糖醛酸化代谢产物）；第90天（图4D）的血中移行成分中，31个为高度相关成分。其中，10个来源于茯苓（包括茯苓新酸C、茯苓新酸B、16-脱氧茯苓新酸B、去氢土莫酸、土莫酸、25-甲氧基茯苓新酸、茯苓新酸D脱水代谢产物、去乙基茯苓新酸C，去乙基土莫酸葡萄糖醛酸化代谢产物、去乙基茯苓新酸E），9个来源于人参（包括人参皂苷Rf，丙二酰基人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、人参皂苷Ra1、人参皂苷Ra2、三七皂苷R1、丙二酰基人参皂苷Rc），12个来源于远志（包括乙酸苯酯、远志讪酮Ⅰ、去乙基远志讪酮Ⅰ葡萄糖醛酸化代谢产物、6,8-二羟基-1,2,3-三甲氧基讪酮葡萄糖醛酸化代谢产物、去乙基远志苷D葡萄糖醛酸化代谢产物、6-羟基-1,2,3,7-四甲氧基讪酮葡萄糖醛酸化代谢产物、远志讪酮Ⅰ葡萄糖醛酸化代谢产物、去乙基E-3,4,5-三甲氧基肉桂酸葡萄糖醛酸化代谢产物、去乙基远志讪酮Ⅱ葡萄糖醛酸化代谢产物、远志讪酮Ⅱ葡萄糖醛酸化代谢产物、E-3,4,5-三甲氧基肉桂酸葡萄糖醛酸化的代谢产物、1,6,7-三羟基-2,3-二甲氧基讪酮葡萄糖醛酸化代谢产物、去乙基E-3,4,5-三甲氧基肉桂酸）。以上表明在伴随给药剂量的增加，相关性成分增加，高度相关性成分增加。
图4 AD模型大鼠尿液生物标记物与血中移行成分相对峰面积关联性分析Heatmap图 注：A.第15天；B.第45天。
续图4 AD模型大鼠尿液生物标记物与血中移行成分相对峰面积关联性分析Heatmap图 注：C.第60天；D.第90天。 4 讨论 在开心散干预AD大鼠模型复制过程中，代谢物的异常表达得到回调，代谢通路的紊乱得到改善。在代谢层面验证了开心散对AD模型疾病发展的的减缓作用。现代药理研究结果证明，开心散四味药材均能在不同程度上起到益智的作用，从而使开心散起到益智、抗氧化、抗自由基损伤的效果。高度关联的入血成分中，来源于君药人参的人参皂苷原型成分最多，推测人参皂苷在体内直接发挥其作用。人参皂苷Rb1对AD动物模型的学习记忆功能下降有明显的改善，并且对大脑皮层神经元也有保护作用。活化的小胶质细胞可释放大量的神经毒素因子，导致神经元细胞功能损伤甚至凋亡，而引发中枢神经系统炎症反应，最终导致AD。研究发现人参皂苷Rb2能够降低小胶质细胞活化对大鼠皮层神经元的损伤，保护神经元。三七皂苷R1对心血管系统，中枢神经系统，免疫系统等均具有保护作用，还有抗炎及抗癌等作用。而高度相关的血中药物代谢产物中，多为远志中化学成分的代谢产物，推测远志中的成分多通过机体代谢转化产生药效。远志自古以来就是治疗痴呆的常用药物。现代研究证明，远志中的活性成分，如皂苷类、寡糖酯类、山酮类化合物等可以通过改善胆碱能系统功能、抗氧化清除自由基、保护神经元等不同途径对AD产生治疗作用。 综上所述，本研究利用UPLC-MS技术，结合中药血清药物化学方法和代谢组学的研究方法，分析表征开心散体内外成分，以及给药后AD大鼠模型的行为学和代谢组学药效评价，明确在干预AD模型大鼠有效性的前题下，分析发现入血的成分中多与造模引起的内源性表达异常的脂类标记物表现出高度的关联，推测开心散可能通过抑制氧化应激从而改善AD模型的疾病状态，延缓AD的发展进程。本研究的成功实施，为从开心散体内成分中筛选用于AD早期多靶点干预的有效成分组合奠定基础，而中医方证代谢组学是解决中药有效性等相关科学问题的新策略。
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