微生物基因组数据上传——它在NCBI等你

拿到数据后想上传到NCBI数据库，奈何攻略千千万，一个不想看，尤其是数据库中一连串的英文注意事项和步骤看起来也是略烦，那不妨看看我这个上传步骤，可否博您一笑？

上传步骤

BioProject ID的获得

1. 在NCBI 主页右上角（http://www.ncbi.nlm./genomes/mpfsubmission.cgi）My NCBI登录系统中创建新的账号（已有就不需要），点击Register for an account 创建账号：

2. 填写信息

3. 登陆BioProject（https://submit.ncbi.nlm./），获取一个BioProject ID 

4. 点击New submission，进行提交

5. 填写一系列信息

6. 获得BioProject ID，以PRJNA字符为前缀，并且获得通过Autogenerate（自动分配）方式获得项目唯一的 Locus Tag Prefix值，比如下面例子中的4932，该值用于注释结果locus_tag这一项的前缀（注释文件必须含有该值！）如下图中红框所示：

组装结果的准备

1. 生成template (*.sbt)文件，填写submission template form（http://www.ncbi.nlm./WebSub/template.cgi）。template form如下图所示（需要填写提交人的各项信息，姓名，地址，单位，联系方式等等，还有文章的题目以及前面获得的 BioProject ID）：

这里的BioSample指的就是前面的submission

完成后，点击最下方'Create Template'，将该文件以*.sbt格式储存，备用。

2. 准备Contig文件。Contigs序列文件，无gap，即序列中不含N，每个文件不超过10,000条序列。格式：contig文件为标准fasta格式，第一行是描述信息，以“>”开头；第二行起是序列信息，每行长度不超过80个字符。如下图所示：

3. 注释文件（可选）。若有符合 NCBI注释标准的注释文件，该文件与*.fsa文件命名相同，后缀为*.tbl。

NCBI注释标准：Prokaryotic Genome Annotation Guide

利用tbl2asn软件生成符合NCBI上传规则的*.sqn 文件

1. 准备生成*.sqn 文件。该文件需要两个文件：1）前面所生成的*.sbt；2）诺禾提供的contig文件：*.fsa；3）（如果有），符合 NCBI注释标准的*.tbl注释文件。

2. 下载 tbl2asn软件，下载地址如下：

ftp://ftp.ncbi./toolbox/ncbi_tools/converters/by_program/tbl2asn/

该软件说明如下：

http://www.ncbi.nlm./genbank/tbl2asn2.html

3. 将以上两个文件置于 tbl2asn 软件目录下，进入命令提示行模式（开始-运行-cmd），进入 tbl2asn软件目录，输入如下命令后回车运行（注意空格和””号）：

tbl2asn.exe –i *.fsa –t *.sbt –a s –V v –Z log –j “[organism=*][strain=*]”

[organism=*][strain=*]：*部分的内容需要自行添加；顺利运行后，tbl2asn 将出现由*.fsa 命名的三个文件：*.sqn，*.val，log（文件名相同后缀不同）。*.sqn文件用于最后的提交作业；一般来说，*.val文件大小为  0 k则整个转换过程无问题。

关于参数organism，strain使用时候的注意事项以及内容请查看：

http://www.ncbi.nlm./Sequin/modifiers.html

以及http://www.ncbi.nlm./Sequin/sequin.hlp.html#ModifiersPage

tbl2asn软件的其他参数说明请参考：

http://www.ncbi.nlm./genbank/tbl2asn2

4. 检查输出的  *.val文件和报告文件。查看*.val文件内是否提示错误信息，如果有，找出并解决，以减少上传审核时间。

5. 生成  AGP文件：（该文件由诺禾提供）

组装序列的提交

1. 使用GenomesMacroSend工具上传前面步骤所得到的*.sqn 文件和 AGP文件。若有符合NCBI注释标准的注释文件也可一起上传。网址如下：

https://submit.ncbi.nlm./subs/wgs/

2. 按照上传引导填写相应信息，上传*.sqn，AGP.file，*.seq文件，整个过程需要使用一致的物种名称。

3. 最后点击Submit，上传成功 NCBI会反馈如下信息，包括临时的GDsub号（Submission，SUB前缀，待审核通过之后才会给予正式编号），之前申请的BioProject号（Title），以及状态（Status），accession number。

4. 完成前两步后会收到一封NCBI的确认邮件。

而完成图，区别在于Create Template后，多了*.cmt（The Genome-Assembly-Data Structured Comment File）文件的生成，包括组装方法和版本、测序基因组覆盖度、测序策略等。

填写 the Structured Comment Template page：

https://submit.ncbi.nlm./structcomment/genomes/

因为没有AGP文件，最后使用GenomesMacroSend工具上传*.sqn 文件即可。

微生物业务线  张黎杰丨文案

王   迪丨编辑