案例经过
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作者：张时民（北京协和医院检验科） 案例经过 最近发现一例患者的血小板结果因冷球蛋白血症干扰，导致原为极低的计数结果假性升高至正常，导致检验结果与临床表现不符。此类病例相关报道极为少见，现介绍如下： 患者，女，43岁，因“反复紫癜1年余，少尿3月，间断便血、黑便1月余”于2013年7月22日第二次入住我院急诊观察室，并于8月2日转入肾内科病房。入院诊断为：冷球蛋白血症性血管炎（含急性肾损伤、多发周围神经病变、消化道出血、横纹肌溶解）、阴道出血原因待查、重度贫血、十二指肠球部溃疡（前壁）、肺部感染、慢性乙肝病毒感染、心包囊肿不除外。 入院实验室检查： 血常规：WBC 3.1×109/L，RBC 1.7×1012/L，HGB 49.0g/L，PLT 49.0×109/L，RET 2.29%； 尿常规：PRO≥3.0g/L，BLD 200/μL； 便潜血（＋）； 肝肾功能：ALT 81.0IU/L，ALB 25.0g/L，Cr 330.0μmol/L； Coomb’s实验（－），冷球蛋白定性（＋）； C3： 0.1g/L，C4 ：0.01g/L，IgG ：2.3g/L，IgM ：1.1g/L，IgA ：0.6g/L，RF ：359.5IU/ml； 血清蛋白电泳：M蛋白0.4g/L、1.30.00%； 血游离轻链定量：κ 140.0mg/L，λ 17.2mg/L，κ/λ 8.14； 血清免疫固定电泳：IgMκ（＋）； 乙型肝炎表面抗原定量（＋）2366IU/ml，乙型肝炎病毒DNA测定49IU/ml，丙型肝炎病毒RNA定量＜103拷贝/ml； 巨细胞病毒-DNA ：5000拷贝/ml。
图1 ：血常规结果中PLT波动图 在2013年7月22日至2013年8月5日期间，共进行16次血常规检测，PLT检测数值波动较大，其中有7次PLT计数落在正常参考区间（100.0~300.0×109/L）内，最高值为216.0×109/L（图1），有5次结果＜50×109/L，甚至2次到危急值水平，每次血小板降低时均镜检确认了结果，未见血小板聚集现象。临床计划为患者进行肾穿检查，但对血小板出现如此大的波动而感到不安，并要求检验科研究是否存在血小板计数干扰问题，并给出正确结果。 1、不同方法血小板计数观察：为寻求原因，笔者于2013年8月6日采用多种方法进行验证并查找资料，发现一些文献报道冷球蛋白血症确实可以影响PLT计数。 我们首先采用以下4种方法验证血小板计数结果： ①涂片镜检观察显示血小板少见，且未见聚集现象； ②显微镜直接计数法（操作详见《全国临床检验操作规程》第3版）； ③血液分析仪计数法（不同通道、不同温度，图3~5）； ④流式细胞仪法（此为金标准）。 显微镜法、仪器计数法及流式细胞仪法检测结果见表1。 表1： 冷球蛋白血症患者的不同仪器检测PLT结果（×109/L） ND为未做；SYSMEX XE-5000为PLT-O通道； SYSMEX XN-2000为PLT-F通道； Siemens Advia 2120仪器采用光学法测定。 2、温度变化观察：为了解是否为环境温度因素导致PLT计数错误，我们进行了不同温度条件下的复查。首先将常规室温条件下送来的标本进行测定，然后置37度水浴箱内90min后测定，最后再回归室温放置3h后复查。 见表2显示Siemens Advia2120血细胞分析仪测定结果与散点图改变（三次结果均未现任何PLT报警信息）。 表2： Siemens Advia2120血细胞分析仪测定结果与散点图 我们还使用了SYSMEX XE-5000对该样本进行了分析（见表3），首先在常温条件下检测血小板数量正常，直方图正常，无任何报警提示；然后放37度水浴2h后复查，血小板数量明显降低，直方图异常，同时散点图也显示血小板数量低下。一般情况下仪器默认检测方法为阻抗法。再将标本放置室温1小时后，用XE-5000再次复查测定，PLT数值恢复为117.0×109/L。 表3： SYSMEX XE-5000检测PLT直方图和光学法散点图 3、血涂片观察：在对样本进行测定的同时，我们还对血涂片进行了细致的观察，并在不同温度条件下对其血片上的出现的各种现象进行了观察，判断和分析。
图2： 血涂片中的不规则有形成分沉淀现象。 室温条件下的涂片，血片中不规则有形成分明显易见（A、B）；37度水浴后涂片，不规则有形成分明显减少或消失（C、D）（×1000，瑞姬染色） 在室温条件下推的血涂片中，不规则有形成分非常明显，而在将标本放置在37度水浴一段时间后再次立即涂片，不规则有形成分明显减少或消失。而这种不规则有形成分极有可能就是凝聚成颗粒状态的冷球蛋白成分，在Advia2120散点图下方的白色区域，所显示的是体积小且不含任何血小板成分的颗粒（白色散点），它可以影响血小板计数。 分析与体会 与体会 冷球蛋白是一种含有类风湿因子和单克隆或多克隆的免疫球蛋白， 由B 淋巴细胞增殖所致， 在低温时产生沉淀的免疫复合物，为冷诱导沉淀物。冷球蛋白已被报道在各种感染、肾、肝、自身免疫、血液以及肿瘤性疾病出现，临床表现包括血小板减少性紫癜、雷诺氏综合征、关节痛、周围神经炎或肾脏疾病[1-2]。 本例病人为确诊的冷球蛋白血症性血管炎合并多脏器疾病，实验室检查符合冷球蛋白血症的特征。有文献报道[2]称在血涂片中，冷球蛋白表现为细胞外的沉淀物，小、亮、薄、不定形性是其特征，其析出温度是可变的，在4℃和37℃之间发生可逆，在室温下（18~ 25℃）易致其快速生成。本例病人在常温条件下制备的血涂片中确实可以见到大量不定形物质沉淀（图2A、图2B），当将血液在37℃水浴中加温后再推片观察，发现这种不定型物质明显减少，在有的视野中消失（图2C、图2D），这与冷球蛋白的性质相符，可以判断这些不定性物质是可以导致血小板计数的异常增高。 ADVIA 2120检测PLT采用二维光散射测量，Y轴表示PLT体积（低角度散射光），X轴表示PLT内容物（高角度散射光），可测体积至60fl的大血小板。从表2所附三张散点图可以看出，白色区域的散点代表干扰物质，大多数白色散点落在PLT计数域（上下两界限）之外，但在计数域内有许多的交叉，特别是常温条件下这种交叉区域内出现的散点非常之多，直接导致了PLT计数结果受到影响。而37度水浴后这个交叉干扰区域散点明显减少，且明显分开，这与冷球蛋白在37度环境下出现可逆性溶解变化有关，这一点在血涂片上已经得到证实。 SYSMEX XE-5000血细胞分析仪的阻抗法通道也出现同样的现象，在室温条件下阻抗法测定PLT结果为120.0×109/L，直方图正常且未出现任何报警信息。放置37℃水浴1h后取出立即检测，其阻抗法和光学通道都给出了较低的PLT结果，再将标本放置室温1小时后，用XE-5000检测PLT值再次恢复为117×109/L，检测数值再次落在PLT正常检测区间。 而XE-5000仪器默认采用阻抗法测定血小板，主要检测＜35fl的血小板，该病例直方图曲线正常、无干扰和异常报警信息；XE-5000可以同时开启光学法通道时，查看仪器的研究参数发现（图3）本病例PLT光学通道结果是8×109/L，阻抗通道是120×109/L，两方法间测定结果相差显著，且未出现报警信息，而此时仪器电脑系统自动选择了120×109/L的结果进行报告，令人费解。而在常规测定条件下，阻抗法检测模式下，这种冷球蛋白存在所导致的血小板计数结果假性升高至正常范围，且无报警信息的情况比较难于发现。
图3：XE-5000研究参数报告 同时发现在常温条件下使用XE- 5000的PLT测定的光学通道与XN-2000的荧光通道（PLT-F）通道即获得低值PLT结果，二者原理相似，采用不同荧光物质对PLT大小、PLT内的RNA进行准确的荧光定量，可以排除干扰物质干扰，而XN-2000的阻抗通道对这种冷球蛋白病例也会出现假性增高现象（图4）。 图4：XN-2000三个通道检测血小板结果 （PLT-I：阻抗法；PLT-O：光学法；PLT-F：荧光染色法） 我们还使用了非常规的流式细胞仪法，该方法可以作为血小板检测的金标准方法，用以对特殊病例的血小板数量进行精准分析。我们选用CD41/CD61直标荧光抗体，该法以异硫氰酸荧光素标记单克隆抗体连结的糖蛋白（GP）Ⅱb/Ⅲa受体亚单位的GPⅢa部分，这种糖蛋白被所有人类血小板表达，但红细胞、白细胞不表达，并且不受冷球蛋白的干扰，该法可计数血小板至＜1×109/L。 本标本经多种方法验证后，在化验单中报告PLT计数为5×109/L，并告知临床，建议此病人的全部标本用保温瓶储存并快速送检。随后骨髓涂片结果显示全片共计数巨核细胞9个，颗粒巨4个、裸巨5个，血小板少见，诊断符合血小板减少症，低值血小板的检测结果再次得以验证。 本例病人为危重病人，多次复检血常规，经回顾性分析，送往急诊化验室的标本PLT结果普遍偏低，可能与急诊化验送检及时、上机较快，冷球蛋白沉淀形成不多有关。冷球蛋白血症致PLT检测假性升高或正常鲜有报道，且文献中提及病例或是PLT直方图异常报警提示[2-3]或是PLT计数异常增高达3056.1×109/L[4]，均触发复检规则后发现为冷球蛋白血症干扰所致。 国外一篇文献报道某冷球蛋白血症患者使用Beckman Coulter T540和Bayer Advia120血细胞分析仪多次测定血常规[5]，其PLT多在1000~2000×109/L之间，而经37℃水浴30min后，血小板计数结果回复正常水平。以上两病例均为血小板计数极高，一般超出实验室设定的复检规则上限（＞1000×109/L），进行复检时比较容易发现问题。 而本例病人实为血小板减低患者，其血小板假性升高至正常范围则比较少见，也难以发现，该病人既往报告最高一次PLT计数为216×109/L，均未提示异常报警，且未出现文献中提及的典型的三角影带（冷球蛋白峰）[2-3]，此外检验人员对此类病例经验不足，故易造成漏诊。 此外国外还有文献报道了在外周血和腹腔积液中发现冷球蛋白的报道[6]，其中有白细胞吞噬这种冷球蛋白所形成的不规则颗粒现象及涂片上出现的不规则颗粒现象，都为我们在观察血涂片时发现不规则有形成分，并将其归纳为冷球蛋白形成的颗粒，对血小板计数造成干扰提供了佐证。 预防措施：今后在复检规则中应该添加凡诊断为冷球蛋白血症患者，均需镜检核实血小板计数结果是否相符。凡使用双方法原理检测PLT的血细胞分析仪，不同方法之间差异如果偏大，应镜检复核结果。 尽量观察仪器散点图和直方图，注意发现与正常散点图或直方图不同的特殊病例，并细致观察，发现问题应镜检复核结果，去除各种干扰因素。有条件的单位可以使用流式细胞仪法进行最终确认。 参考文献（略） |
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