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编译 | 新锐恒丰研究院（节选） 来源 | David V. Butruille等18人，密苏里，圣路易市，孟山都公司，全球玉米育种 PlantBreeding Review, Vol. 39,1st edition 双单倍体 Doubled Haploids A.双单倍体的优势 Benefits of Doubled Haploids 现代玉米育种的第一步是从现有父母亲本，选育新自交系。需要至少自交 6代到 7 代固定基因组大部分基因，这样新系就会停止分离。使用单倍体加倍方法，可以更快产生新自交系。单倍体植株只有一套单一基因及一组染色体。染色体加倍之后，形成两套完全相同基因的染色体。所有基因都是纯合。双单系快速纯合提供玉米育种一些好处。它可以缩短育种年限，所有隐性基因缺点马上暴露，以及所有个体植株遗传变异及缺点立即显现，改善表现性选拔的品质。 ▲ 来源：agrigold.com B.单倍体的产生 Haploid Creation 玉米跟许多其他作物一样，可以使用组织外培养技术产生单倍体。虽然玉米花药及小孢子培养有进展，但是成功仅限于某些基因型个体。学者分析美国 4 个花培自交系，证实它们的花药培养反应的遗传特性。基因型以及低频率限制了组培技术在玉米育种的实际利用。 ▲ 来源：TIM_CUPKA，2013 illinois corn breeder school 配子体不确定隐性基因（ig或indeterminate gametophyte）可以导致不正常胚囊发育以及无核卵子。使用纯合的 ig 植株做母本，供体花粉做父本授粉，可以产生 1-3% 父本型单倍体子粒。由于单倍体细胞核来自父本，细胞质来自母本，可以有效提供细胞质雄性不育系统的有效转换。不需回交很多世代，只需一代就可转换细胞质。然而由于效率比较低，这种双单系育种方法，不如下列体细胞母本单细胞方法有效。 ▲ 来源：TIM_CUPKA，2013 illinois corn breeder school 柯（Coe）1959 年发现墨西哥粉质玉米 Stock 6，自交及作为花粉时，可以产生 2-3% 的单倍体。这是一个非常有效的双单系生产方法，因为只需诱导系花粉做父本，可以在隔离苗圃（ICB或Isolated Crossing Block）与许多母本杂交。几乎所有单倍体来自母本，具有母本供体的遗传基因组及细胞质。世界有许多科研单位已经有效改良单倍体诱导频率，某些诱导系的诱导频率高于 10% 。 ▲ 来源：TIM_CUPKA，2013 illinois corn breeder school 诱导母本单倍体的机制有两种学说。Wedzony 等的学说，认为花粉粒的一个精细胞有缺陷。与卵核授精之后，在胚发育中，精核基因组退化而被排除。成为只有母本单倍体卵细胞及三倍体胚乳。Chalyk 等认为一个精核没有与卵核结合，未受精卵核直接传达胚囊发育信息。目前有一个可以解释 66%单倍体遗传变异的数量性状基因位点已经确认在 243kb 区域范围内。可以帮助进一步了解单倍体诱导机制及数量性状基因的克隆。 C.单倍体的鉴定 Haploid Identification 最常用的单倍体鉴定是使用显性花青素标记 R1-nj。这个基因在显性花青素基因 A1, A2 及 C2 存在时，使用诱导系花粉与正常黄色子粒受体杂交，产生的二倍体子粒有紫色冠顶及紫色胚芽鞘，单倍体子粒则是紫色冠顶及无色胚芽鞘。这个鉴定方法不适用于世界上少量带有抑制 R1 花青素形成的显性基因 C1-I, C2-Idf 及 In1-D 受体种质。这些种质与诱导系杂交后，子粒是黄色，没有紫色冠顶及紫色胚芽鞘，不能区别二倍体及单倍体子粒。 ▲ 来源：TIM_CUPKA，2013 illinois corn breeder school 此外，植株发芽早期，花青素基因 B1 及 Pl1，可以表现紫色胚芽尖及根尖。因此二倍体幼苗表现紫色，单倍体植株没有紫色。如果诱导系带有独特的基因标记，则可以使用分子标记方法鉴别单倍体。子粒带有独特标记是二倍体种子，如果没有标记，就是单倍体。然而分子标记取样及分析时间比较长，成本比肉眼观察贵。好处是非常精确及具有普遍的适用性。 Geiger 等将抗杀草剂基因转到诱导系上面，二倍体子代抗杀草剂，单倍体子粒则对杀草剂敏感。这个方法在大面积作业时比较费工，因为单倍体对杀草剂敏感，药剂使用量不能太高，凋萎的单倍体幼苗需要马上清洗药害并移栽，在温室保护下，慢慢恢复植株健康。因此有一定的成活率风险。中国农大使用子粒油分含量高低来分别二倍体及单倍体子粒。这个方法在自动化一章会讨论。 D.染色体加倍 Chromosome Doubling 单倍体玉米植株的一些体细胞会经由自然的细胞融合，细胞内加倍，核内有丝分裂或其他机制加倍为二倍体组织，产生可孕的花粉及胚囊。通常，雄花可孕程度比雌花要低，同时不同基因型的可孕程度不同。如果要产生可靠的双单系，必需使用化学药剂加倍，提高加倍频率及加倍的一致性。 ▲ 来源：Gordillo，2010 illinois corn breeder school 秋水仙素是目前最广泛使用的染色体加倍剂。玉米单倍体染色体加倍开始并不有效，直到 1994 年 Gayen 等，以及 1997 年 Deimling 等发明切除刚发芽单倍体胚芽鞘尖端的高效方法，然后将切除尖端的幼苗，放在摄氏 18度，0.06% 秋水仙素，及 0.5% DMSO 溶液中 12 小时。处理后，幼苗用水清洗，在保护环境恢复几天，然后移栽人移栽盒或田间。这是目前许多公司单倍体计划使用的加倍流程。 ▲ 来源：Gordillo，2010 illinois corn breeder school 秋水仙素的挑战是它的毒性。某些杀草剂，比如甲基氨草灵（amiprophos-methyl），氨磺乐灵（oryzalin），戊炔草胺（pronamid），及福乐灵（trifluralin）的毒性比较低，同时可以有效阻止有丝分裂及促进玉米细胞染色体加倍。Kato 2002 年成功使用二氧化氮（nitrous oxide gas）气体，成功加倍玉米单倍体。这些药剂可以作为比秋水仙素廉价，安全的染色体加倍剂。虽然染色体加倍技术已经改良，但是加倍效率仍然是玉米双单系生产的主要瓶颈。使用来自花药的单倍体组织或来自诱导系杂交所产生的单倍体胚组织，利用组培技术加倍的成功率会比较高。但是成本比较高，以及吞吐量有限。注：文章没有说明孟山都使用的杀草剂。 E.对认定的双单系植株的照顾 Care of PutativeDoubled Haploid Plants 幼苗在秋水仙素等化学药剂加倍之后，一般都很脆弱而很容易受伤。典型的操作是种植在具有最佳温度，湿度，土壤及光线条件的保护环境（温室或遮荫房）的育苗盒。在移栽以前，可以让这些脆弱幼苗恢复。同样，组培产生的可能双单系，需要移栽温室数周，让他们适应自然环境之后，移栽田间。可以在田间使用遮荫网来减少光线及高温造成的损害。适当的农艺管理，包括灌溉，施肥，杂草及虫害，是保持单倍体加倍生产成功的关键。 ▲ 来源：Gordillo，2010 illinois corn breeder school |
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