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首先是一些基础知识：
1
Affymetrix芯片的数据格式主要有.dat和.cel两种。DAT文件是原始芯片图像的扫描文件，需要用affy公司自己的软件打开。CEL文件是DAT文件去除背景噪音后的文件，包括了每个探针的原始密度数值（raw
intensity
value）。其中，我们最关注CEL文件，这也是我们后续载入Bioconductor中的原始数据类型。后续需要对CEL文件进行“质量评估”、“归一化”、“注释”等一系列预处理。
2
 芯片质量控制：
1. 对于“探针数据（probe-data level）”的三种图，使用"affy"
package
boxplot(
)：未处理的原始探针密度（以2为底取对数）的盒箱图。
评价标准：代表各个芯片的“盒箱”是否在同一个水平上。如果出现像f那样的“断层”，也不能推断f芯片出现质量问题，因为可能通过“归一化（normalization）”使其在同一个水平上。
 hist( )：计算未处理的原始探针密度（以2为底取对数）的直方图，实际画出的是平滑的密度曲线。
评价标准：查看所有芯片中是否有异常过高的密度值。下图中可能出现如a芯片（红色）的“双峰”曲线，表明其密度曲线服从"bimodal
distribution(双峰分布)"（什么是双峰分布）。
这表明a芯片可能有“人为空白（spatial artifact）”的质量缺陷。
 MAplot( )：查看每张芯片的MA-plot
评价标准：通过红色的“loess
smoother
curve”与y=0的关系衡量芯片的质量。如果红色曲线在蓝色直线上下摆动的很厉害，同时数值过高，暗示该张芯片可能存在质量问题（a图就是一个例子）。
 2. Affymetrix自己的质量控制标准，使用“simpleaffy”
package。以下的四组数值的判断需要小心谨慎，最好的办法是同时计算四个数值，之后对其综合评价。不能因为其中某一个数值出现异常，就拒绝某张芯片。（感想：基基因芯片技术确实含有太多的不确定因素，这个平台稳定性相对于RNAseq确实差很多。虽然microarray创造了举世瞩目的成就，但是我们也应该看到其不足，同时积极接受新的实验技术。这同时说明了“meta-analysis”的思路是比较正确的。）
这四个数值都是由Affymetrix公司提供的MAS5.0“归一化”算法计算得出，对其他归一化方法如gcrma和rma无效。但可以使用这个package中的call.exprs("MyCEL",
"normallizaiton")函数进行快速归一化，如MAS5.0, rma, gcrma等。
svbg( )：Average Background
衡量标准：所有的芯片应该有差不多的数值。如果出现过高数值，比如f芯片，可能表示该芯片存在质量问题。average
background数值过高原因可能是：进行杂交实验过程中cRNA上样量较大；或者某次杂交过程中反应效率过高；或者是荧光标记量过大；还有可能是制造了一块“太亮”的芯片板子。
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> avbg(Data.qc)
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sfs( )：scale
factor。芯片在做“归一化”的时候，很多方法（比如MAS5.0）都采用一个共同的假设：在数量巨大的转录组中，只有一小部分基因（或探针集）发生显著变化。一个例子：HG-U133-plus2.0型号芯片中～54000个探针集中，只有～200个探针集发生差异化表达。因此，就有一个推论：在所有芯片中，“修正过的密度均值（trimmed
mean intensity）”应该是一个定值。MAS5.0中，使用一个scale
factor使得所有芯片的均值都同一个到一个恒定值。如果scale
factor过高，表明该芯片探针集整体密度偏低，暗示杂交过程中RNA量过低。这个scale
factor实际上衡量了一张芯片上有多少mRNA杂交上。
衡量标准：Affymetrix公司推荐，所有芯片的scale
factor的差异应该控制在3倍以内（3-fold）。如果差异过大，比如f和g，表明芯片可能在芯片制作、RNA提取、杂交或者扫描中出现质量问题。这将违背“归一化”的前提假设，所以再厉害的“归一化”算法也挽救不了一张不合格的芯片。
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>
[1]
[8]
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percent present(
)：affy芯片中对探针杂交质量评定有三种PMA，分别是Present/Marginal/Absent。如果探针集被标记位P或者A，表示PM数值与MM相比，没有显著差异。
衡量标准：percent
present给出的是该芯片中，探针集被标记为P的百分比。该值越大，表示探针杂交的越充分。但是，percent present与scale
factor一样，我们应该对其谨慎评定，因为有的细胞的确比别的细胞表达的基因多。
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> percent.present(Data.qc)
a.present b.present c.present d.present e.present f.present
g.present h.present
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ratios( )：衡量mRNA的降解程度。affy芯片使用两个基因beta-actin和GAPDH各自的3'和5'探针密度的比值，衡量mRAN的降解。因为这两个基因都比较长（有多长？），如果3'和5'探针密度的比值较大，说明芯片杂交过程有很多RNA片段，即降解现象（想象mRAN的降解图）。
衡量标准：Affymetrix给出的限度是3，即3'和5'探针密度的比值在3以下，表明芯片质量可靠。
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> ratios(Data.qc)
a
b
c
d
e
f
g
h
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plot( )：整体画出以上四个数值。
 衡量标准：最左边是每个样本名称；每个样本对应两个数值，一个是百分比数值（percent present），另一个是average background。中间蓝色区域表示scale factor的接受域（3倍），一个个“路灯线”就是每个样本scale factor。圆圈和三角表示beta-actin和GAPDH各自的3'和5'探针密度的比值ratio，两条黑虚线表示ratio接受域（3倍）。图中红色表示可能有问题，蓝色表示质量较好。要对四个数值综合评定，一个指标有问题不能说明全局有问题。 RNAdeg( )/summmaryAffyRNAdeg(
)/plotAffyRNAdeg( )：由"affy”
package提供的另外一个的控制RNA降解的显示图。
衡量标准：采用slope的数值大小进行衡量。但是，很遗憾，到底多大的slope表示RNA出现降解，大家并没有一个确定的数值。而且，slope可能与不同芯片平台有关。从以往经验上看，对于高质量的RNA，HG-U95和MG-U74平台的slope是0.5，HG-U133A是1.7。建议如果在这个数值之上超过2，那么可能出现RNA降解。
如果没有slope经验估计值，那么芯片之间的slope的大小相似，则认为RNA质量可控。如果出现一个或者几个芯片的slope过高，则暗示这些芯片可能出现质量问题，比如RNA处理手段或者RNA放大存在问题。
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> summaryAffyRNAdeg(RNAdeg)
slope
pvalue 0.002 0.00962 5.56e-05 7.37e-05 0.00683 0.00589 0.00723
0.00256
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 3.
Mbox( )：绘制RLM（Raltive Log
Expression）图
boxplot( )：绘制NUSE（Normalized
Unscaled Standard Error）图
衡量标准：在PLM和NUSE图中，如果某个芯片的盒箱图与其他出现偏差，比如下图中的2，那么该芯片可能存在质量问题。说明：标号为2的芯片质量问题，出现了一个人工痕迹（artifact），比如“环”
  有用的网址：
affy有用的
http://bioinformatics.picr./research/software/simpleaffy/algorithms.html
这个网站做的非常好，需要关注其中的database和publication
参考网址：
1 DAT和CEL等各种affy文件类型说明
2 一个非常好的介绍simpleaffy中四个参数的文档
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