怎么处理表达量低的基因？

 2017-03-06 

OmicShare问答第四期

基因表达量计算和差异表达分析

OmicShare问答栏目由各位OmicShare网友在线交流课堂中，问交流嘉宾的问答整理。旨在解答众网友的疑问，普度众生。所以，你来问我呀。

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问1：3个生物重复样品是分别建库测序得到3个数据好，还是将3个重复样品混合在一起，建一个文库测序，得到一个数据好？

答：当然是单独建库，分别做差异分析这样是最好的。如果混样测序了，就没有办法计算组内差异了，那么审稿人就会质疑这个实验没有重复。

问2：在没有重复实验的情况下，用RPKM要怎么做检验呢？

答：如果要用泊松分布做差异分析模型的话，必须要用reads count的。只有RPKM值的话，可以用RPKM的公式反推reads count数，再做检验。

问3：没有生物学重复，用DEGseq算之前需要均一化吗？

答：理论上用Deseq或者edgeR的话，其实不需要做均一化的，只要将reads count作为输入，软件会自动做相应的处理。我们说的均一化是说我们需要了解方法与过程，均一化是软件自动完成的。

问4：miRNA表达量是比较低的，是不是现在没有生物学重复，这个差异基因的检出期望值会减少？

答：其实miRNA表达量不低，实际上表达量是相当高。一般来说，miRNA表达量有几个特点，首先变异很大，现在在样本内那些高丰度的miRNA与低丰度的miRNA差异非常大，可能相差几万倍甚至几十万倍；另外个体间的miRNA丰度也是变异非常大的。所以做miRNA测序，往往可能得到的P值相对于转录组测序没那么显著的。

问5：Deseq是怎么控制reads多重比对的？

答：Deseq只是一个差异分析的软件，多重比对的分配是在Deseq之前的。Deseq是输入的数据是已经分配好的reads count，然后用于分析，但是如果reads 多重比对要怎么处理的，那么要使用reads分配分析软件，例如cufflinks或Rsem软件。所以Deseq是不能处理多重比对的，应该之前用软件进行预处理。一般来说多重比对有两种方案：

1）如果一个reads多重比对的话，可以把多重比对的reads删除掉，

2）使用cufflinks 和 Rsem分配比对结果bam文件；

如果不关心可变剪切的差异，策略1也是合理的。如果关心可变剪切，则建议策略2。

问6：Deseq、edgeR和cuffdiff在处理多重比对reads的时候差别是什么？

答：Deseq 与edgeR只是一个差异分析的软件，就是类似于做方差分析的软件一样。但cufflinks是个软件包，从数据比对到reads count 到差异分析都全包了，所以如何处理多重比对的reads是与 Deseq或者edgeR是无关的。 可以用cufflinks或者RSEM来做多重比对的处理，然后做差异分析，则可以继续选用 Cuffdiff 、Deseq或 edgeR。

问7：用TMM标准化之后再用基于泊松分布的差异分析算法，计算差异基因靠谱吗？

答：TMM标准化的确是独立的方法。既然有生物学重复就不建议用泊松分布模型。因为TMM是edgeR的归一化算法，建议后续的差异分析继续使用edgeR。泊松分布可以做差异分析，但是这个方法无法估算生物样本之间的个体差异。所以他最后是相当于低估了P值，统计结果是存在较大假阳性。

问8：如果想比较环境对基因表达的差异，分别从两个地区各取三株样品，比较组间差异可以吗？

答：可以。这个方法是可行的，但是有一点，目前我们认为RNA-seq最大问题是如果只测三个生物学重复，对模式生物来说还是OK的，比如小鼠、拟南芥，他们个体差异很小。我们知道个体差异本来就是组内差异的一部分。所以对于模式生物来说一开始个体差异是非常小的。但是如果从两个区域取样的话，而且非模式生物学样本，例如林木、昆虫，可能个体差异会比较大，容易得到组间差异不显著的结论。所以想得到一些更稳定的指标的话，建议用混样作为生物学重复来做差异比较将会更加稳定。

用混样作为样本的逻辑是这样的， 比如在某个区域取到30个样本，然后把每10个样本混成一个池，比如前十个，中间十个，后面十个，构成三个样本池，这个时候其实这三个样本池还是不一样的。生物学重复本身就是假设是抽样，从一个大样本中抽样，来计算抽样误差多大，如果将个体作为重复的话，这种个体差异比较大， 这样就导致抽样误差比较大。但是如果以群体作为样本的话，因为群体的均值更加稳定，得到样本间差异将更小，所以我们才会建议所有样本混合成若干池，这样减少抽样误差。

问题8有3种解决方案：

1. 通过生物学重复样本的数量来提高P值，因为个体差异大，理论上增加生物学重复样本的数量可以减少干扰；

2. 可以考虑将多个个体混合池作为样本，减少差异；

3. 如果说经费有限，不想设重复，就只有对照组与处理组比较，这样用泊松分布也可能做差异分析模型的，但是这样得到的结果无法证明差异得到的miRNA是处理导致的差异还是随机误差导致的差异，所以这样筛到的miRNA还是需要实时荧光定量的方法，单个样本进行验证来证明在处理组之间是存在差异的。

问9：怎么处理表达量低的基因？现在有没有统一的标准呢？比如说RPKM或者counts为多少的时候可以忽略不计或者近似看成某个值？ 

答：表达量低的基因目前没有标准，一般文献认为RPKM值小于1或者小于4 或者这个基因的reads数量小于1或者小于3就认为是不表达的。一般情况下，一个基因的表达量极低比如RPKM值为小于1，这个基因就被认为低丰度，至少是没有太大生物学意义。

当然如果处理组或者对照组，两组RPKM值都小于1，那么这个基因丰度如此低，那么他是没有多大生物学意义的，所以对后续分析与讨论这样的基因可以忽略不计。我们认为这些基因完全可以在结果里剔除。