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亲爱的各位小伙伴，我们又见面啦~过去的一周，大家是不是沉浸在“追剧”的狂热情绪中无法自拔了呢？
毕竟，《人民的名义》真的是好看又烧脑，引得广大群群众纷纷参与到热烈的剧情讨论中。
以至于小编上个微博，才刚摸到搜索栏还没开始打字，就跳出了这样的一串内容：
在同一PCR反应中实现两个或更多基因序列的扩增和特异性检测，随之而来的是丰富的实验可能性，简直不要太引人入胜~
那么，接下去，就让我们来系统地了解一下“多重实时荧光定量 PCR”吧~
▼ 多重反应简介 PCR 多重反应是指在同一个反应中实现两个或更多基因序列的扩增和特异性检测。要获得成功，PCR 多重反应必须能够生成针对目的序列的足够的扩增产物。多重实时荧光定量 PCR 可同时产生定性和定量的结果。对于多重荧光定量PCR，所有的目的序列的扩增必须能产生足够的指数期信号。对于定性结果，如果扩增产物足够，也可利用终点检测方法 (如凝胶电泳) 检测所有目的序列。
后缀“plex”可用于多个术语。单重 (Singleplex) 反应是一种旨在扩增单个基因序列的分析。双重 (Duplex) 反应是两个PCR 反应的组合，旨在同时扩增两个基因序列。多重反应最常见的类型是双重反应，它是在同一孔内进行靶基因和对照或标准品基因序列分析；多于两重的更多重的反应也是可实现的。
一些商品化的实时荧光定量 PCR 试剂盒就是作为多重反应进行设计和验证的。例如，MicroSEQ? E.Coli O157:H7试剂盒采用了内部阳性对照和大肠杆菌 靶点多重反应。在研究应用领域，通常由科学家来选择采用哪种多重反应分析，并负责多重反应的验证。在考虑是否建立多重反应分析时，权衡多重反应与所需的验证工作的利弊至关重要。 多重反应的三个优点：更高的通量 (每块反应板可分析更多样本)、更低的样本用量和试剂用量——取决于实验中的靶点数。例如，如果定量实验中只包括一个靶点分析，在同一反应中加入标准品分析，如内参，进行双重反应靶点分析将提高2倍的通量，同时每个样本减少一半的样本用量和试剂用量。但如果定量实验包括两个靶点分析，可将两个靶点反应与一个标准品反应组合成三重反应。在这种情况下，样本用量和试剂用量将进一步降低。 如果同时进行靶点和标准品多重反应，则多重反应还具有另一个优点——使加样精度错误最小化。同一孔的靶点和标准品数据来源于一次加样，因此任何加样精度错误应对靶点和标准品结果具有同等影响。为获得精度优势，必须采用同一孔的标准品数据对靶点数据进行标准化，然后计算技术重复的精度。比较利用单重反应方式分析的数据 (未经过基于孔的标准化) 与利用多重反应方式完成的分析，证明多重反应的精度优势较大，具体取决于单重反应的错误。例如，对于单重反应精度错误极少的样本，多重反应的精度优势也微乎其微。
对于需要更高精度的定量实验，多重反应的精度优势显得尤为重要。例如，在拷贝数变异实验中，区分1拷贝基因与2拷贝基因是2倍差异，需要良好的精度。但区分 2 拷贝基因与 3 拷贝基因仅为1.5的差异，这需要更高的精度。对于此类型的实验，推荐采用多重反应方法，其有助于达到该实验所需的精度。 多重反应分析通常需要在同一孔内加入多种染料。实时荧光定量 PCR 仪必须能够准确地检测同一孔内的不同染料信号。这些测量必须保持针对各染料的特异性，即便当一种染料信号明显高于其它信号时。 实时荧光定量 PCR 多重反应的最佳荧光试剂是那些可以指定不同染料来检测多重反应中的各个基因序列的试剂。
绝大多数多重分析采用了多种染料、高特异性的试剂，如基于 TaqMan? 探针的 Assay。对于 RNA 多重反应分析，我们一般推荐两步法 RT-PCR，而非一步法 RT-PCR。一步法 RT-PCR 要求逆转录和 PCR的引物浓度相同，降低了多重反应引物浓度的灵活性。而在两步法 RT-PCR 中，可对 PCR 引物浓度进行多重反应优化，且不会影响逆转录。 TaqMan? Multiplex Master Mix TaqMan? QSY?探针引入了专利的不发荧光的3' QSY淬灭基团，以便在多重检测应用中充分提高PCR性能，在为您带来TaqMan检测所固有的灵敏度和特异性的同时，给您的real-time PCR检测设计又增添一把利器。新开发的QSY淬灭基团可搭配FAM?、VIC?、ABY?和JUN?报告基团染料进行多重qPCR检测。该QSY淬灭基团不发荧光，可降低本底干扰，同时提升淬灭效果。 TaqMan? QSY?探针 采用TaqMan? QSY探针进行多重检测可以节省成本，减少样品用量，同时还可以通过一次定量试验，获得堪比4次单管反应的结果。 单重反应的结果与多重检测的结果相近。扩增图显示了4个EGFR探针进行单重(蓝色)和4重反应扩增的检测曲线线性度比例，试验中每10μL反应物依次采用了按比例稀释的20,000 pg至2 pg参照克隆cDNA。 假定采用的是多染料实时荧光定量 PCR 荧光试剂，则多重反应中各种基因序列的检测将需要不同的报告基团染料。同一孔内的报告基团染料必须被实时荧光定量 PCR仪充分激发并准确检测。仪器生产商应能够提供推荐染料。请注意，Applied Biosystems? 实时荧光定量PCR 预混液中包含一种红色的参比荧光染料。仅带有蓝色激发光的仪器可充分激发基于ROX?染料的参比荧光染料，但蓝色激发光一般不足以激发用作报告基团的红色染料。 无需根据靶基因或基因产物的类型指定报告基团染料，但遵循染料的指定模式可简化多重分析的构建。例如，FAM? 染料是 TaqMan? 探针中最常用的报告基团染料。我们遵循其模式指定 FAM? 染料作为靶点分析的报告基团染料，并指定 VIC? 染料作为标准品分析的报告基团染料。采用此模式，可通过将不同的 FAM? 染料标记的靶点分析与相同的标准品分析 VIC? 染料进行配对，构建多个双链分析。进行三重分析时，可将第三种染料 ABY? 或JUN? 染料与 FAM? 染料和 VIC? 染料相结合。请注意，如使用 ABY? 染料，则在同一孔内不应有 TAMRA? 染料存在，如果使用 JUN? 染料，MUSTANG PURPLE? 应该作为参考标准取代 ROX? 染料。 多重反应 PCR 饱和 多重反应 PCR 饱和是当丰度更高的基因扩增使热稳定性DNA 聚合酶饱和时，多重分析中可能出现的不良现象，它抑制了较低丰度基因的扩增。饱和的补救措施是减少丰度更高的靶点的 PCR 引物的浓度，称为“引物限制”。引物限制的浓度应足够实现几何扩增，但需在 PCR 产物聚集到遏制较低丰度靶点扩增之前使引物耗竭。计划多重分析时，研究人员应根据 PCR 反应中各基因和基因产物的 DNA 或 cDNA 绝对丰度，识别多重反应中哪种基因或哪些基因有可能引起饱和。为此我们列出了三种最常见的双链情景：
双重反应情景① 在这个最常见的情景中，所有样本中丰度更高的基因或基因产物均相同。仅丰度更高的靶点分析需要引物限制。例如，标准品可能是 18S 核糖体 RNA，其占真核细胞总RNA 的 20%。每个样本中 18S rRNA cDNA 的丰度高于任意mRNA cDNA。因此仅 18S 分析需要引物限制。
双重反应情景② 在本情景中，两个基因在所有样本中的丰度几乎相同。一般而言，两种基因的 Ct 差异为 3 或者更高，假定阈值相同，则认为两个基因的丰度不同。基因组 DNA 应用领域 (如拷贝数差异) 最可能出现此情景。情景 2 无需引物限制，因为两种基因几乎同时经历几何扩增期。
双重反应情景③ 在本情景中，基因或基因产物的丰度明显高于其它。此时，两种分析均应为引物限制。 多重反应引物相互作用 影响多重分析性能的另一个潜在威胁是不同分析的引物间不必要的相互作用。引物相互作用的风险会随反应中分析数目的增加而提高，因为随着多重反应分析数的增加，出现的引物对的数目会随之大幅增加。例如，在包含4个PCR 引物的双重反应分析中，可能有6种不同的PCR引物对，在包含6个PCR引物的三重分析中，则可能有 15 种不同的PCR引物对。在单重反应中，每个分析可能都运行得很好，但在多重反应中，引物的相互作用可形成竞争产物，抑制扩增的进行。当多重反应分析具有同源性时，引物相互作用的几率会提高。如果基于单重反应与多重反应的 Ct 值存在明显差异的观察得出存在引物的相互作用的现象，则补救措施是对之前的多重反应的实验采用不同的 Assay 进行。
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