  实时荧光定量PCR（ Real-Time qPCR）是分子生物学最常用的一种方法，它无疑是每个生物实验者的必备技能！然而对于大多初入实验的小白来说，qPCR真的一点都不Q，想要做出完美的实验数据需要过关斩将、披荆斩棘、克服重重困难！ Never mind！ 本帖跟随小麦探索qPCR内心世界！ 1 qPCR基本原理 在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。 视频讲解： qPCR介绍-Introduction to qPCR   专业英语Tips 模板 template ，序列 sequence 检测 detect， 灵敏 sensitive 2 qPCR应用 目前，qPCR技术已经广泛应用于生物医药食品等行业，应用于疾病的早期诊断、遗传病的早期诊断、药物研究、肿瘤的诊断与研究、食品病原微生物的检测、转基因食品检测、动物疫病检测等，还包括： ● 基因扩增 ● 扩增特异性分析 ● 基因定量分析 ● 基因检测 ● 基因分型 ● SNP分析 ● RFLP多态性分析 ● 单/多基因表达研究 ● 高通量基因表达谱研究 …… 3 qPCR常用方法 染料法 荧光染料可与双链DNA结合，每个循环的延伸阶段，染料掺入双链DNA中，其荧光信号强度与PCR产物的数量呈正相关。同时，其缺点也在于其非特异性。当PCR反应中有引物二聚体或者非特异性扩增时，该染料也可以和这些非特异性扩增产物结合，发出荧光，从而干扰对特异性产物的准确定量。 常用的染料为SYBR Green I，各公司针对荧光信号强度、抑制作用等进行改进，也推出了很多新的染料供大家选择。 Promega采用新型荧光染料BRYT Green® Dye，对qPCR反应没有抑制作用，与双链DNA结合后荧光信号更强. 探针法 在PCR扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸：5’端标记一个报告荧光基团，3’端标记一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。 下表对两种方法进行对比：
视频讲解： 染料法vs探针法-qPCR:Dye vs Probe 实验室小工具 专业英语Tips 溶解曲线 melt curve ， 变性 denature 报告分子reporter ，猝灭剂 quencher 4 qPCR一般步骤 提取RNA ——RT-PCR ——以cDNA为模板检测 Real-Time qPCR MasterMix一般为预混液，只需要加入模板和引物就可以。在操作过程中，还需要根据所用Master Mix、模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。 参比染料（reference dye）的作用是校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。有些公司是把ROX或者其他染料配制在MasteMix里面；也有的是单独分开。要根据不同公司的MasterMix进行这一个步骤的选择。 由于进行qPCR前需要将RNA反转录为cDNA，因此可以根据实验选择1步法（RT-PCR和qPCR在同一管中进行）或2步法（RT-PCR和qPCR分开进行）。 下表为大家总结了两种方法如何选择及优势：
视频讲解： 一步法vs两步法-1step vs 2step 实验室小工具 GoTaq® Probe 1-Step RT-qPCR System GoTaq® Probe 2-Step RT-qPCR System 专业英语Tips 逆转录酶 reverse transcriptase 热循环 thermal cycling 5 qPCR常见参数 基线(baseline)：通常是3-15个循环的荧光信号 阈值(threshold)：自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 Ct值：与起始浓度的对数成线性关系，分析定量时候一般取Ct:15-35 Rn(Normalized reporter)：荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。 △Rn：△Rn是Rn扣除基线后得到的标准化结果  qPCR定量方法 绝对定量和相对定量的区别在于，绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品，必须做标准曲线。相对定量可以做标准曲线，也可以不做标准曲线。 |
|
|
来自： stingray928 > 《生物》
