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Hi，小伙伴们，本周继续我们的RT之旅，在上期的内容中我们介绍了RT-qPCR的第一步——反转录，讲到怎样获得高质量的cDNA模板，那么接下来就需要用我们获得的模板去做定量PCR，在此之前大家要了解什么是定量PCR，定量PCR的原理是什么，只有知道了这些，我们才能较为顺利的去定量。所以，本期我们将为大家着重介绍RT-qPCR中定量的原理，希望对大家有所帮助。 我们先来回顾一下常规PCR和荧光定量PCR的区别，常规PCR是对PCR的最终产物进行定性和半定量分析，最终只能通过跑胶看出结果；荧光定量PCR则是根据荧光信号的变化，实时检测每个循环扩增产物的变化，从而达到对初始模板量的定性和定量分析。 那么荧光定量PCR是怎样进行的呢？下面我们将按照三方面的原理来逐步解析其工作原理： 一、荧光定量PCR仪的系统原理 在定量PCR仪中主要包含三大系统，PCR热循环系统、光路系统以及荧光检测系统。仪器在工作过程中，由PCR热循环系统进行目标序列的扩增，由光路系统对PCR产物的荧光物质进行激发，最后由检测系统对激发的荧光进行检测统计，最后得到每个循环中产物的扩增量，将其转化为成为扩增曲线，用于之后的定性或定量研究。 二、荧光定量PCR工作的化学原理 目前最常用的荧光定量PCR方式主要有两种，一是染料法，另一个是探针法。 1、染料法 以SYBR Green I 染料为例， SYBRGreen I 是一种DNA双链小沟结合染料，游离时发光极微弱，结合DNA后荧光强度明显增强。每形成一条双链，就有相应数目的SYBRGreen I 嵌入，并产生荧光信号，荧光的强度与体系中双链的浓度成正比，从而保证了荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步，荧光的强度就代表了体系中双链产物的浓度。其大致的工作流程如下图： 此种方法当然也会有它的优缺点，优点是成本低， SYBRGreen I 试剂价格低，适合初步筛查目标基因；缺点是无特异性，针对所有双链形式DNA均有荧光基团嵌入，给出所有双链DNA的总荧光信号，不能进行多重筛查，每个PCR管中只能检测一个目标基因。 2、探针法 以TaqMan 探针为例，TaqMan 探针是一段寡核苷酸单链，与目标DNA互补，探针两端分别有一个报告基团和一个淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，不会检测到荧光，PCR扩增时，Taq DNA聚合酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，报告基团释放并发出荧光。每合成一条DNA链，就会切断一条探针，并产生一个单位荧光信号，信号的强度与结合到DNA链上的探针成正比。 那么自然的探针法也会有它的优缺点，优点是特异性高，探针为目标基因特异性结合序列，增加检测特异性，可进行多重基因筛查，同一体系，多个基因同时筛查，不同基因对应不同探针，不同探针对应不同荧光标记；缺点是成本高，探针合成的价格较高，多重基因筛查需保证不同探针含不同荧光标记，不能互相干扰。 三、荧光定量PCR工作的数学原理 由于荧光定量PCR最后我们得到的数据就是Ct值，所以在了解其数学原理前，我们有必要先了解一下荧光定量PCR的几个动力学参数。根据扩增曲线趋势，整个扩增过程大致分为四个时期：基线期、指数增长期、线性增长其及平台期。 （1）基线：扩增曲线的水平部分，是荧光信号明显增强前的背景荧光值，是测量偶然偏差产生，一般机器默认值为3-15，需根据具体情况做调整； （2）指数增长期：在PCR初期，PCR反应中每一个循环的产物量与初始模板量符合这种指数关系的时期； （3）线性增长期：随着反应不断进行，产物对PCR反应的抑制、taq酶的消耗的因素的影响，退火不仅仅发生在模板与引物之间，导致PCR反应的效率不断降低，PCR产物量与初始模板量不再呈现指数关系，PCR反应逐渐进入线性期； （4）平台期：PCR产物不再随着循环数的增加而增加。 前面我们提到荧光定量PCR最后我们得到的数据就是Ct值，那么何为Ct值？如何用Ct值计算初始模板量？Ct值是指从基线到指数增长期的拐点所对应的循环数。用数学公式来体现PCR整个过程如下图： 现实的PCR扩增中受扩增酶以及引物等的影响，是存在扩增效率的，因此产物的分子数并不能按照理想公式来计算。带入扩增效率，然后公式两边取对数，那么当扩增循环数是Ct时，公式变为lgN0 =［-lg(1+e)］×Ct + lgNCt，模板起始分子数的对数与循环数（Ct值）呈线性关系，Ct值越大，模板起始分子数约少，这就是Ct值用来定量的数学原理。 |
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