|
实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）是一项以 PCR 反应为基础的 DNA 定量技术，通过对目标基因在扩增过程中产生的拷贝数进行实时的定量，从而达到对目的基因的定性和定量分析。常用的对 PCR 产物进行荧光定量检测的方法有两种：一种是利用荧光染料与双链 DNA 结合，通过荧光强度进行定量；另一种是利用携带了荧光报告基团的特异DNA 探针对目标基因进行定量。 一种最为常用的定量方法就是在 PCR 反应体系中加入荧光染料，此类荧光染料会与所有的双链 DNA 结合，并产生荧光。游离的荧光分子不会产生荧光信号，只有与双链 DNA 结合的荧光分子才会释放荧光，随着 DNA 拷贝数的增加，测得的荧光强度也会增强。 利用荧光染料进行定量的优势就是成本低廉，只需要一对普通的引物就能完成定量。然而，常用的诸如 SYBR Green 染料会与所有的双链 DNA 无差别地结合，包括引物二聚体， 因此有可能会导致对目标基因的定量不精确，灵敏度偏低。
二、利用荧光探针进行定量 使用探针进行荧光定量的优点就是精确度和灵敏度都要比荧光染料高，且可以做到同时对多个基因进行定量，但是相应的合成探针的成本也要比使用荧光染料高出许多。
下面以细胞样品为例详细介绍了荧光定量PCR实验所需材料、试剂、仪器以及完整的实验步骤方法，供大家学习交流。 实验材料：细胞样品 实验试剂：RNA提取试剂盒、荧光定量PCR Mix、TRIZOL、dNTP、氯仿、逆转录酶MMLV、异丙醇、Taq酶、DEPC水、ddH2O、TE、MgCl2、琼脂糖、溴化乙锭、MOPS、甲醛、乙酸钠、EDTA、EB、溴酚兰 实验仪器：离心管、离心机、风光光度计、电泳槽、凝胶板、Realtime PCR仪 实验步骤： 1.样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每 1ml 的 TRIZOL 试剂裂解的祥品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后 ，15℃到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。 RNA 全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀：将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀。 其中的RNA,混匀后15℃到30℃孵育10分钟后，千4℃下12000rpm离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗：移去上清液，每1ml TRIZ OL 试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇( 75%乙醇用 DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟． ⑤RNA干燥：小心吸去大部分乙醇溶液 ，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀：溶解RNA时 ，先加入无RNA酶的水40µl用枪反复吹打几次，使其完全溶解 ，获得的 RNA 溶液保存于-80℃待用． 2.RNA质量检测 1）紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。 ①浓度测定 A260下读值为1表示40 ug RNA/ml。样品RNA浓度(mug/ml)计算公式为：A260 x 稀释倍数 x 40 ug/ml。 具体计算如下： 1g琼脂糖溶于72 ml水中，冷却至60℃，10 ml的10 x MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。 10x MOPS电泳缓冲液 ②准备RNA样品 取3ug RNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10 ug/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。 ③电泳 上样前凝胶须预电泳5 min，随后将样品加入上样孔。5-6 V/cm电压下2 h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3 cm。 ④紫外透射光下观察并拍照 28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。 3.样品cDNA合成 ①反应体系 ②混合液在加入逆转录酶MMLV之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5 ul，37℃水浴60分钟。 ③取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。 ①β-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011，反应前取3 μl按10倍稀释（加水27 ul并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。 ②反应体系如下： 标准品反应体系 管家基因反应体系： ③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃ 2分钟，然后93℃ 1分钟，55℃ 2分钟，共40个循环。 5.制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板 ①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。 ②反应体系 35个PCR循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）；72℃延伸5分钟。 ③PCR产物与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。 ④将PCR产物进行10倍梯度稀释: 将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为1x1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。 6.待测样品的待测基因实时定量PCR ①所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。 ②体系配置如下: ③将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：93℃ 2分钟预变性，然后按93℃ 1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃7分钟延伸。 7.实时定量PCR使用引物列表 引物设计软件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。 8.电泳  Test3： 结果分析： |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|
