4 梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因(β-actin)实时定量PCR ①β-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011,反应前取3μl按10倍稀释(加水27μl并充分混匀)为1010,依次稀释至109、108、107、106、105、104,以备用。 ②反应体系如下: 标准品反应体系 序号 反应物 剂量 1 SYBR Green 1 染料 10μl 2 阳性模板上游引物F 0.5μl 3 阳性模板下游引物R 0.5μl 4 dNTP 0.5μl 5 Taq酶 1μl 6 阳性模板DNA 5μl 7 ddH2O 32.5μl 8 总体积 50μl 轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。 管家基因反应体系: 序号 反应物 剂量 1 SYBR Green 1 染料 10μl 2 内参照上游引物F 0.5μl 3 内参照下游引物R 0.5μl 4 dNTP 0.5μl 5 Taq酶 1μl 6 待测样品cDNA 5μl 7 ddH2O 32.5μl 8 总体积 50μl 轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。 ③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机,反应条件为:93℃ 2分钟,然后93℃ 1分钟,55℃ 2分钟,共40个循环。 5 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板 ①针对每一需要测量的基因,选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。 反应体系: 序号 反应物 剂量 1 10× PCR缓冲液 2.5 ul 2 MgCl2 溶液 1.5 ul 3 上游引物F 0.5 ul 4 下游引物R 0.5 ul 5 dNTP混合液 3 ul 6 Taq聚合酶 1 ul 7 cDNA 1 ul 8 加水至总体积为 25ul 轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。 35个PCR循环(94℃1分钟;55℃1分钟;72℃1分钟); 72?C延伸5分钟。 ②PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。 ③将PCR产物进行10倍梯度稀释: 将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为1×1010,依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。 6 待测样品的待测基因实时定量PCR ①所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。 体系配置如下: 序号 反应物 剂量 1 SYBR Green 1 染料 10 ul 2 上游引物 1ul 3 下游引物 1ul 4 dNTP 1ul 5 Taq聚合酶 2ul 6 待测样品cDNA 5ul 7 ddH2O 30ul 8 总体积 50 ul 轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。 ②将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为:93℃2分钟预变性,然后按93℃ 1分钟,55℃1分钟,72℃1分钟,共40做个循环,最后72℃7分钟延伸。 7 实时定量PCR使用引物列表 引物设计软件:Primer Premier 5.0,并遵循以下原则:引物与模板的序列紧密互补;引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构;引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。 8 电泳 各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳,GoldView?染色,检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
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