如何在线设计siRNA？

今天我们来学学siRNA的设计

1. siRNA原理

siRNA为 small interfering RNA的缩写，siRNA与靶向特异性的mRNA结合，通过RNA介导的沉默复合体RISC（RNA-induce siliencing complex）介导mRNA的降解。siRNA长度一般为21-23nt，被RISC识别结合之后，siRNA发生解旋。然后RISC在siRNA的反义链指导下，寻找具有同源序列的内源性的mRNA，并在距离5’端10-11位剪辑之间切割mRNA，从而导致转录后基因沉默。

siRNA的原理如下：

也可以来看一看RNAi的视频介绍：

2. siRNA设计原则

RNAi发挥作用的核心在于siRNA的序列结构，因此不同的siRNA导致的沉默效果差异非常巨大。影响siRNA功能因素主要包括siRNA序列结构特点、靶向mRNA的空间结构、RISC与siRNA的相互作用、以及siRNA与mRNA错配。目前siRNA设计的原则有两种方式：

(1) 统计不同siRNA对靶序列抑制程度得到siRNA设计原则。这个原则就是统计目前已有的siRNA序列，根据序列特点和序列沉默效果分析得到。

    a. GC含量在30%-52%

    b. 有义链15-19位至少有3个A或者U

    c. 避免出现倒置重复，以防形成发卡结构

    d. 有义链的第3位核苷酸为A

    e. 有义链的第10位核苷酸为U

     f. 有义链的第19位核苷酸为A

    g. 有义链的第19位核苷酸不能为G或C

    h. 有义链的第13位核苷酸不能为G

(2) 以siRNA序列上的能量为依据，筛选有效序列。

    a. 总的siRNA双联能量<>

    b. 反义链5'端的结合能<>

    c. 有义链的5'端结合能在5-9

    e. GC含量在36%-53%

    f. 中间7-12位的结合能<>

    g. 反义链5’端与正义链5'端的能量差最好在-1~0

3. siRNA设计步骤

首先选择一个靶基因的目的片段位置，并显示出代表性的siRNA序列；

其次从候选的siRNA中排除含有SNP位点的和位于非开放阅读框架的片段；

接下来去除一些不利siRNA序列，如简并碱基、毒性结构域、重复序列、高GC/低GC序列；

然后从热烈学、高级结构等打分，列出从高到低的序列；

 随后将siRNA片段进行Blast分析，去除非特异结合的序列；

最后预设计几条siRNA序列

4. siRNA在线设计网址

siRNA有很多在线设计工具。我们今天介绍两个在线设计工具，以p21为例，我们在pubmed上面找到其mRNA的序列。并得到FASTA格式的序列：

首先我们来看一下第一个在线设计工具，我们打开网址 http://sidirect2./

在上面的界面中，我们可以输入Accestion number，我们也可以直接输入FASTA格式的序列，直接点击“design siRNA”即可，或者可以点击 Options，进行一些其他的设置。稍等片刻，得到如下的结果：

结果中显示了目标位置，靶序列，RNA oligo等一些其他的信息。

接下来我们看一下另外一个在线工具，同样以p21为例，打开下面网址：http://biodev.extra./DSIR/DSIR.html

这个在线工具中，只能输入FASTA数据。然后点击“Run analysis”得到如下的结果：

这个结果中，排名越靠前，预测的效果越好。我们结合第一个在线工具来分析，发现在696附近的siRNA序列在两种预测软件中都有，所以我们可以选择在696附近的序列作为我们待验证的siRNA序列。当然最终效果是否好，还得看预实验验证。

当然现在很多公司都提供siRNA设计服务，你只需要将你的目的序列交给他们，他们就会帮你合成3条siRNA序列。