| 【摘要】： 瘢痕疙瘩是创伤愈合过程中形成的一种病理性瘢痕。其主要特征是成纤维细胞的异常增殖，以及以胶原为主的细胞外基质在真皮内过度沉积。瘢痕疙瘩在亚洲人群中较为常见，但迄今为止发病机制尚不明确。目前多采用联合治疗的方法，但仍不能解决瘢痕疙瘩的复发难题。本文集中研究在体外培养条件下，一些主要生物活性因子以及Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达情况，比较其与正常皮肤成纤维细胞间的差别。同时，进一步研究在不同浓度曲尼司特作用下成纤维细胞增殖、生物活性因子合成和Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因表达的变化，探讨曲尼司特抗瘢痕疙瘩增生的可能机制。 首先，建立了来自瘢痕疙瘩患者和正常对照的成纤维细胞株，并比较了两种成纤维细胞的生长曲线。在无血清培养条件下，两者的一代生长期均呈指数增长。瘢痕疙瘩成纤维细胞的数量倍增时间为42小时，正常皮肤成纤维细胞的数量倍增时间为57.6小时，两者有明显差异。 其次，采用无血清培养的方法，探讨正常皮肤和瘢痕疙瘩成纤维细胞自分泌表达转化生长因子-β_1(TGF-β_1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和白细胞介素-6(IL-6)的能力，以及不同浓度曲尼司特对这些表达的影响。用双抗体夹心ABC-ELISA法测定各个时段各孔上清液中上述因子的含量。结果提示：(1)瘢痕疙瘩成纤维细胞较正常皮肤分泌更多的TGF-β_1，曲尼司特可以明显抑制它的表达。与对照组相比，25μg／ml曲尼司特作用24、96小时，50μg／ml和250μg／ml曲尼司特作用24、72、96小时后，瘢痕疙瘩成纤维细胞在TGF-β_1的表达上差异有统计学意义(P＜0.05)。(2)瘢痕疙瘩成纤维细胞分泌的bFGF较正常略微升高，曲尼司特可以促进其表达，在24、72小时尤其明显。与对照组相比，50μg／ml曲尼司特作用24、72小时，250μg／ml曲尼司特作用24、72、96小时后，瘢痕疙瘩成纤维细胞在bFGF的表达上差异有统计学意义(P＜0.05)。(3)瘢痕疙瘩成纤维细胞在72、96小时较正常皮肤分泌更高的IL-6，曲尼司特可降低这种表达。与对照组相比，10μg／ml、25μg／ml和50μg／ml曲尼司特作用96小时，250μg／ml曲尼司特作用72、96小时后，瘢痕疙瘩成纤维细胞在IL-6的表达上差异有统计学意义(P＜0.05)。曲尼司特对正常皮肤成纤维细胞的影响大致相似。多因素方差分析显示，浓度和时间、浓度和细胞来源、时间和细胞来源之间对上述生物活性因子的表达可产生不同的交互作用。 最后，进一步探讨曲尼司特对正常皮肤和瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖及Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达的影响。曲尼司特对正常皮肤和瘢痕疙瘩Fb的形态学影响相似。较高浓度曲尼司特作用下，可观察到Fb胞质中有显著的空泡形成，随着药物浓度增加或作用时间延长，空泡逐渐增多，且出现空泡的Fb也逐渐增多。这些细胞生长缓慢，最终皱缩、脱落或走向凋亡。在低浓度曲尼司特作用下，空泡化现象并不明显，但随作用时间延长，细胞间隙增宽，细胞略有皱缩。MTT法检测显示，加入不同浓度曲尼司特后，正常皮肤和瘢痕疙瘩成纤维细胞的OD值较对照明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。随着曲尼司特的浓度增加，其OD值逐渐呈下降趋势，提示成纤维细胞生长受抑。 继而，采用RT—PCR方法分析瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞在Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达上的差别，瘢痕疙瘩组Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达均较正常皮肤组有明显增加，其中Ⅰ型约是正常皮肤组的1.28倍，Ⅲ型约是正常皮肤组的1.54倍。曲尼司特能抑制正常皮肤和瘢痕疙瘩成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达，且随着浓度增加这种作用越加明显。与对照组相比，250μg／ml和500μg／ml曲尼司特干预后，瘢痕疙瘩成纤维细胞在Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA的表达上差异有统计学意义(P＜0.05)，提示其具有抑制胶原合成的能力。 综上所述，无论在细胞增殖速度、生物活性因子自分泌，还是Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因表达方面，瘢痕疙瘩的成纤维细胞较正常均有较明显的不同。一定浓度的曲尼司特可减少瘢痕疙瘩成纤维细胞TGF-β_1和IL-6的表达，增加bFGF的表达，从而发挥抗纤维化的作用。曲尼司特的干预能抑制成纤维细胞增殖，抑制Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达，从而减少胶原的合成。因此，曲尼司特具有很好的临床应用前景，可进一步进行相关的动物或人体实验，为临床开发奠定基础。 |
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